[發明專利]固態發酵微生物總DNA提取方法

無效

• 申請號: 200710035676.4
• 申請日: 2007-09-03
• 公開（公告）號: CN101148664A
• 公開（公告）日: 2008-03-26
• 發明（設計）人: 宋琳玲;曾光明;陳耀寧;范長征;王仁佑
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所
• 代理人: 田嘉嘉

技術領域

本發明涉及DNA提取方法，具體涉及固態發酵中微生物總DNA提取方法。

背景技術

固態發酵是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固態支持物，其體系無水或接近于無水的任何發酵過程，微生物的生長及所形成的產物均在基質的表面。隨著能源危機與環境問題的日益嚴重，固態發酵技術以其特有的優點(如無“三廢”排放)引起人們極大的興趣；同時充分開發利用固態發酵這一技術來生產人們所需發酵產品，已受到世界各國科技工作者的關注；而微生物在固態發酵過程中扮演十分重要的角色。因此，研究固態發酵中微生物的生物多樣性和菌落演替情況，將有助于我們更深入地了解固態發酵發生的機理，從而更好地實現對其技術的控制和優化。

目前，研究固態發酵樣中微生物菌落的多樣性以及菌落演替主要運用傳統的顯微鏡法、平板法和biolog法，而這些方法都借助于微生物培養法，這必將導致失去很多非培養性物種信息，從而使研究不全面。然而建立在分子生物學技術上研究微生物菌落的多樣性以及菌落演替，克服了微生物的不可培養性，為研究固態發酵樣中微生物菌落的多樣性以及菌落演替提供了新的途徑。

在大多數的分子生物學技術的研究中，關鍵在DNA的提取。目前用于DNA提取的方法很多，但主要集中于細菌DNA的提取，相對比較簡單。但是可以同時提取細菌、放線菌、真菌DNA的方法卻比較罕見。因此，尋找一種可以同時提取細菌、放線菌、真菌DNA的方法，對于固態發酵樣中全面了解這三種菌的菌落變化是非常必要的。

發明內容

本發明的目的在于解決上述現有技術的不足，提供了一種可以同時提取細菌、放線菌、真菌DNA的方法，以全面了解固態發酵樣中微生物的多樣性，從而更好的發揮微生物資源在固態發酵中的應用。

本發明的目的通過以下方案實現：

一種固態發酵微生物總DNA提取方法，包括以下步驟：

a.樣品的洗滌：固態發酵樣須用0.1M磷酸鹽緩沖液洗滌三次；

b.DNA的提取：往上述洗滌后的固態發酵樣中加入異丙醇，用超聲波冰浴超聲，樣品破碎以后，高速離心至樣品完全沉淀，去上清液；往沉淀中加入十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)抽提液，65℃水浴完全反應后，加入等體積的氯仿-異戊醇，高速離心至沉淀完全，并回收水相；在回收水相中加入1/10體積的CTAB-NaCl溶液，65℃水浴待完全反應后，加入等體積的氯仿-異戊醇，再高速離心至沉淀完全，并回收水相；在回收水相中加入0.6倍體積的預冷異丙醇，并在-20℃放置待充分反應后，再高速離心至沉淀完全，去上清液；沉淀用預冷的乙醇重復洗滌和干燥，干燥后的沉淀溶于TE緩沖液中，得到粗提DNA；

c.DNA的純化：上述粗提的DNA經純化試劑盒純化以后，在其純化產物中加入核糖核酸酶，37℃水浴消化，以除去RNA。

所述每1g固態發酵樣中加入異丙醇4mL，所述超聲過程中破碎5.2s，停2.4s，振幅45％，所述氯仿-異戊醇體積比為24∶1，所述每1g沉淀中加入CTAB抽提液1000μL，所述加入的CTAB抽提液中還含有體積百分數為2％的β-巰基乙醇，所述CTAB-NaCl溶液組成為：10mg/mL?CTAB；0.7mol/L?NaCl，所述異丙醇、氯仿、異戊醇質量分數均＞99％，所述加入的核糖核酸酶終濃度為0.5μg/mL。

本發明的優點是：目前，對于環境樣品的分子生態學的研究主要集中于細菌的DNA提取以及后續的研究。而環境樣品中微生物種類是非常豐富的，僅對其中的細菌菌落進行多樣性分析是不夠的，也要對其他幾類菌以及相互作用進行分析。因此有必要尋找一種能獲得真實反映原環境樣品中微生物實際組成狀況的總DNA的方法，并隨后可利用于酶切、連接、PCR和梯度凝膠電泳以及建立克隆文庫和DNA序列測序，從而獲得全面的微生物遺傳信息。本發明針對固態發酵過程是多類微生物共同作用的過程，提供了一種可以同時、全面研究真菌、細菌、放線菌的動態變化以及其種類多樣性的途徑。此方法可同時成功的提取固態發酵樣中細菌、放線菌、真菌的總DNA并能獲得較高、較純的DNA產量，且均能成功的擴增出細菌、放線菌、真菌的目的條帶和獲得相當高產量的PCR產物，并可用于后續遺傳多樣性等分析。是一種快捷、比較經濟適用的固態發酵樣微生物總DNA提取的方法。此外本法不需要特別的儀器，實驗成本相對較低。因此本方法為研究固態發酵樣的分子生態學研究提供了一種快捷，經濟的方法。

附圖說明

圖1：粗提以后和純化以后的固態發酵樣總DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；