[發明專利]TPO基因修飾的人骨髓間質干細胞及其制備方法和用途

有效

• 申請號: 200710034396.1
• 申請日: 2007-02-07
• 公開（公告）號: CN101240263A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 譚孟群;周小瑩
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/861;A61K35/28;A61P7/00
• 代理公司: 中南大學專利中心
• 代理人: 胡燕瑜

技術領域

本發明涉及基因修飾骨髓間質干細胞領域。

背景技術

促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是調節巨核細胞和血小板生成的細胞因子，TPO具有啟動巨核細胞克隆形成、刺激高倍性巨核細胞生成和成熟巨核細胞的產生以及支持功能性血小板生成的全程性功能。

動物實驗表明，重組人TPO在恢復血小板水平、促進其他造血因子活力的功能上比其他造血因子更為有效；臨床實驗也表明重組人TPO能有效減輕化療引發的血小板減少。目前應用于臨床研究的TPO主要有兩種形式：由細菌表達的經PEG修飾的半長分子TPO(PEG-rHuMGDF)和哺乳動物細胞表達的全長的、糖基化的TPO(rhTPO)。然而，多劑量PEG-rHuMGDF治療癌癥患者和用于健康志愿者的實驗研究中發現，PEG-rHuMGDF在應用中產生一種中和抗體，這種PEG-rHuMGDF的Ig?G型抗體與內源性的TPO發生交叉反應，中和了它的生物學效應，繼而發生血小板減少癥。因其副作用，PEG-rHuMGDF已于1998年9月在美國被撤出臨床試驗。而目前對于rhTPO的研究顯示，在rhTPO?II、III期臨床中，癌癥患者體內幾項TPO毒性實驗結果證實rhTPO應用是可行的，但具有心臟、肺、血管或血液病史的患者卻仍是排除在II、III期臨床實驗之列的。

由于反復使用重組TPO可能產生中和抗體的危險及其高額費用，因此，用基因治療的策略代替注射重組TPO來治療血小板減少癥將是另一個重要出路，有著廣闊的發展前景。

骨髓間質干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSCs)和分化的基質細胞組成骨髓微環境，能調節造血干細胞(haemopoietic?stem?cell，HSC)的存活、自我更新、遷移以及分化，產生廣泛的細胞因子。MSCs能產生許多細胞因子支持造血，例如SCF、LIF、SDF-1、OSM、BMP-4、Flt-3、TGF-β、IL-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、IL-12、IL-14、IL-15。MSCs中IL-6，IL-11，LIF，SCF，TPO在轉錄水平均有表達，但是用ELISA方法能檢測到IL-6，IL-11，LIF，SCF蛋白的表達，卻不能檢測到TPO蛋白的表達。如果用TPO基因修飾的MSCs來支持造血細胞的生成，一方面能使TPO協同MSCs分泌的已知或未知的細胞因子支持造血生成；另一方面，能避免在支持造血的體系中另外加入細胞因子。因此，TPO基因修飾的骨髓間質干細胞將成為一種新的促進血小板生成的支持細胞。

發明內容

本發明目的在于用重組腺相關病毒介導TPO基因，將TPO基因轉染到人MSCs，用TPO基因修飾的MSCs來支持造血細胞的生成。

本發明的TPO基因修飾的人骨髓間質干細胞，由重組腺相關病毒將TPO基因介導轉染到人骨髓間質干細胞而獲得。

本發明的TPO基因修飾的人骨髓間質干細胞的具體制備方法包含以下步驟：(1)克隆人胎肝TPO基因，構建載體質粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP(pAAV-TPO)；(2)制備rAAV-TPO病毒載體；(3)培養人骨髓間質干細胞；(4)將rAAV-TPO轉染到人骨髓間質干細胞。

其中，步驟(1)中的TPO基因片段通過EcoR?I酶切后插入pAAV-GFP；構建的質粒pAAV-TPO-IRES-hrGFP在β-globin?intron序列中合成一段引物做為測序引物：ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC。為了繼續檢測TPO基因的全長序列，分別在TPO基因的480bp位置和858bp位置合成測序引物，分別為：5′-GCGTTTCCTGATGCTTGTAG-3′，5′-CAACCTCCAGCCTGGATATT-3′。

步驟(2)采用磷酸鈣共沉淀法將pAAV-TPO、pAAV-RC、pHelper三種質粒共轉染至HEK293而制備得到rAAV-TPO病毒載體。

步驟(4)將rAAV-TPO轉染到人骨髓間質干細胞的過程為：將人MSCs用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化后，用PBS緩沖液洗滌，計數細胞，按1個MSCs加入10⁵顆粒的rAAV-TPO病毒液混勻培養。

步驟(4)中選用的人骨髓間質干細胞最好為生長融合達到80％～90％的第3代人MSCs。

TPO基因修飾的人骨髓間質干細胞，以及TPO基因修飾的人骨髓間質干細胞分泌液，可以用來制備成促血小板生成的藥物，用來治療血小板減少癥。