[發(fā)明專利]急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗PML－RARα－h(huán)GM－CSF及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710032812.4
• 申請(qǐng)日: 2007-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN101214381A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李揚(yáng)秋;岑東芝;胡剛;周羽竝;陳少華;楊力建
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;C12N15/62;C12N15/63;A61P35/02
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于血液腫瘤免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗PML-RARα-hGM-CSF(即pIRES-PML-RARα(384bp)-hGM-CSF)及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

免疫療法治療腫瘤與白血病是目前的一個(gè)趨勢(shì)，DNA疫苗具備諸多傳統(tǒng)疫苗所不能比擬的優(yōu)勢(shì)，能夠誘導(dǎo)特異性體液免疫與細(xì)胞免疫。急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute?promyelocytic?leukemia，APL)是目前治療效果最好的一種白血病，但腫瘤的微小殘留病變(minimal?residual?disease，MRD)卻很難被現(xiàn)行治療方案根除，尋找一種能夠根除APL的MRD的治療方案迫在眉睫。

盡管針對(duì)APL的聯(lián)合化療方案已經(jīng)取得很大進(jìn)展，患者的預(yù)后也有了較大改善，但腫瘤的MRD卻很難被現(xiàn)行治療方案徹底消滅。由于許多白血病患者體內(nèi)都存在由于染色體易位所形成的融合基因，利用融合基因作為誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗白血病治療的靶點(diǎn)已經(jīng)成為眾多研究人員追求的目標(biāo)。由于體外表達(dá)的蛋白不一定具有與體內(nèi)蛋白一致的天然構(gòu)象，而且外源蛋白進(jìn)入體內(nèi)后以誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)為主，而DNA疫苗則能夠有效地克服這些缺陷，同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。利用PML-RARα(早幼粒白血病基因(PML)與維甲酸受體α(RARα)基因)融合基因制備DNA疫苗是有希望根除急性APL的MRD的方法之一。

目前對(duì)于APL的治療主要有傳統(tǒng)化療和誘導(dǎo)分化治療，雖然現(xiàn)有的治療方法已經(jīng)能夠在很大程度上提高患者的生存質(zhì)量，患者的預(yù)后也有了較大改善，但腫瘤的MRD卻很難被現(xiàn)行治療方案徹底消滅。骨髓移植雖然能夠根除MRD，但骨髓來源少，配型成功率低，高昂的移植費(fèi)用以及嚴(yán)重的移植相關(guān)并發(fā)癥限制了該療法的推廣。在化療結(jié)束后輔以APL特異的DNA疫苗治療是有希望根除MRD的方法之一。

大約有70％APL患者體內(nèi)存PML-RARα融合基因，該融合基因是APL發(fā)病以及應(yīng)用全反式維甲酸治療有效的分子基礎(chǔ)，是一個(gè)特異的白血病抗原。表達(dá)PML-RARα融合基因的細(xì)胞可誘導(dǎo)T細(xì)胞克隆性增殖，提示該細(xì)胞內(nèi)的融合蛋白可以被MHC分子加工和提呈到細(xì)胞表面，因此可以利用PML-RARα融合蛋白或融合基因誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，或者誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)PML-RARα的特異性CTL，達(dá)到免疫治療的目的。Padua等研究發(fā)現(xiàn)利用跨越PML-RARα融合基因的融合點(diǎn)的基因片段構(gòu)建的DNA疫苗能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫保護(hù)作用。

目前對(duì)于制備PML-RARα基因疫苗特異性目的基因的選擇尚無定論，如何篩選出具有最佳免疫原性的PML-RARα基因片段仍是此類研究所面臨的核心問題。目前尚未有融合基因pIRES-PML-RARα(384bp)-hGM-CSF的構(gòu)建。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗PML-RARα-hGM-CSF(即pIRES-PML-RARα(384bp)-hGM-CSF重組質(zhì)粒)。該融合基因pIRES-PML-RARα(384bp)-hGM-CSF是能夠在真核細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)PML-RARα和hGM-CSF蛋白的質(zhì)粒。本發(fā)明利用基因克隆和重組技術(shù)構(gòu)建了急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗PML-RARα-hGM-CSF(即pIRES-PML-RARα(384bp)-hGM-CSF重組質(zhì)粒)，并研究了通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后基因和蛋白表達(dá)；小鼠體內(nèi)注射免疫后不同時(shí)期的基因和蛋白表達(dá)、抗體產(chǎn)生和特異性CTL效應(yīng)等的效應(yīng)。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗的應(yīng)用。所述急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗是一種能夠在真核細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)PML-RARα蛋白和hGM-CSF蛋白的DNA疫苗，它能夠誘導(dǎo)APL患者機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)APL細(xì)胞的特異性CTL從而清除患者體內(nèi)的微小殘留病變，達(dá)到治愈APL的目的。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗PML-RARα-hGM-CSF，所述DNA疫苗PML-RARα-hGM-CSF由pIRES質(zhì)粒、PML-RARα基因和hGM-CSF基因組成，所述PML-RARα基因(大小為384bp)序列如下：

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