[發(fā)明專利]急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗PML－RARα－h(huán)GM－CSF及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710032812.4
• 申請(qǐng)日: 2007-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN101214381A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李揚(yáng)秋;岑東芝;胡剛;周羽竝;陳少華;楊力建
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;C12N15/62;C12N15/63;A61P35/02
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗PML-RARα-hGM-CSF，其特征在于，所述DNA疫苗由pIRES質(zhì)粒、PML-RARα基因和hGM-CSF基因組成，所述PML-RARα基因序列如下：

CAAAGCGTCTCCAATACAACGACAGCCCAGAAGAGGAAGTGCAGCCAGA

CCCAGTGCCCCAGGAAGGTCATCAAGATGGAGTCTGAGGAGGGGAAGGAGGCAAGGT

TGGCTCGGAGCTCCCCGGAGCAGCCCAGGCCCAGCACCTCCAAGGCAGTCTCACCACC

CCACCTGGATGGACCGCCTAGCCCCAGGAGCCCCGTCATAGGAAGTGAGGTCTTCCTGC

CCAACAGCAACCACGTGGCCAGTGGCGCCGGGGAGGCAGCCATTGAGACCCAGAGCA

GCAGTTCTGAAGAGATAGTGCCCAGCCCTCCCTCGCCACCCCCTCTACCCCGCATCTACA

AGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACCGC；

所述hGM-CSF基因序列如下：

AGGTCTAGAACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGC

CTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCT

GGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGT

AGAGACACTGCTGCTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAAT

GTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACA

AGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATG

ATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTG

TGCAACCCAGACTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACT

TTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGAATGT

CGACTCT。

2.權(quán)利要求1所述的一種急性早幼粒細(xì)胞白血病DNA疫苗PML-RARα-hGM-CSF的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)首先提取NB4細(xì)胞的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后利用引物P1和P2通過PCR擴(kuò)增出PML-RARα基因；擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物標(biāo)記為PML-RARα，其大小為384bp；

所述的P1：5’CAAAGCATGGTCTCCAATACAACGA?3’，其中，方框內(nèi)GCTAGC為NheI酶切位點(diǎn)；

所述的P2：5’GCGTCAGTCCTGACAGACAAAG?3’，其中方框內(nèi)ACGCGT為MluI酶切位點(diǎn)；

將擴(kuò)增的基因PML-RARα利用T4?DNA連接酶與pIRES質(zhì)粒進(jìn)行連接，插入到pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A中構(gòu)建出pIRES-PML-RARα；

(2)然后通過PCR從pORF-hGM-CSF質(zhì)粒中擴(kuò)增出hGM-CSF基因

以pORF-hGM-CSF質(zhì)粒作為模板，用引物P3和P4?PCR擴(kuò)增hGM-CSF基因，擴(kuò)增的目的片斷hGM-CSF基因長(zhǎng)度為458bp；上游引物為P3，下游引物為P4；

所述的P3：5’AGGACCATGTGGCTGCAGAGC?3’；其中，方框內(nèi)TCTAGA為Xba?I酶切位點(diǎn)；

所述的P4：5’AGAATTCACTCCTGGACTGGC?3’；其中，方框內(nèi)GTCGAC為Sal?I酶切位點(diǎn)；

(3)將上述擴(kuò)增得到的hGM-CSF基因利用T4?DNA連接酶與pIRES質(zhì)粒進(jìn)行連接，插入到pIRES-PML-RARα的多克隆位點(diǎn)B中，經(jīng)過測(cè)序正確后，構(gòu)建了pIRES-PML-RARα-hGM-CSF質(zhì)粒。