[發(fā)明專利]用VP16替代Nanog轉(zhuǎn)錄激活域CD2的Nanog基因突變體、攜帶其的載體,構(gòu)建方法及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710032350.6
• 申請日: 2007-12-11
• 公開（公告）號: CN101457225A
• 公開（公告）日: 2009-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 裴端卿;王哲;馬天驊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C07K14/47;C12N5/06
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及Nanog的突變體，表達該突變體的載體，以及構(gòu)建突變體及載體的方法和它們的用途， 所述Nanog是一個在不依賴于LIF(白血病抑制因子)的情況下能夠維持小鼠胚胎干細(xì)胞自我更新能力的轉(zhuǎn) 錄因子。

背景技術(shù)：

胚胎干細(xì)胞(ES)是唯一能夠生成我們體內(nèi)200多種細(xì)胞類型的多能性細(xì)胞，因此，具有能夠通過移 植恢復(fù)患病或老化器官的無與倫比的潛力(參見，Pan，G?J.等人，(2002)Cell?research?12(5-6)，321-329)。 因此，基于干細(xì)胞的療法是許多現(xiàn)在未解決疾病(例如糖尿病和帕金森氏病)的有前景的解決方案。但是， 需要在人ES細(xì)胞安全和有效地應(yīng)用到人疾病之前必須克服難以克服的障礙。對ES細(xì)胞的基礎(chǔ)生物學(xué)研究 提供了對這些障礙的合理的解決方式，例如將ES細(xì)胞維持在多能性狀態(tài)并且在培養(yǎng)條件下將它們誘導(dǎo)分 化成特定的品系。

小鼠ES細(xì)胞的多能性似乎受到包括Oct4、Sox2、FoxD3和Nanog(Pan，G.J.等人，(2002)Cell?research 12(5-6)，321-329；Pan，G.，等人，(2006)Faseb?J20(10)，1730-1732；Boyer，L.A.，等人，(2005)Cell?122(6)， 947-956；Mitsui，K.，(2003)Cell?113(5)，631-642；Chambers，I.，(2003)Cell?113(5)，643-655)。盡管已經(jīng)通過大 規(guī)模的生物學(xué)工具如微陣列核蛋白組生成了關(guān)于這些干細(xì)胞多能性核心調(diào)節(jié)子的大量數(shù)據(jù)(Boyer，L.A.， 等人，(2005)Cell?122(6)，947-956；Assou，S.等人(2007)Stem?Cells?25(4)，961-973；Orkin，S.H.(2005)Cell 122(6)，828-830；Wang?J.等人(2006)Nature?444(7117)，364-368)，關(guān)于控制其作用機制的分子機制知道的很 少。為此目的，我們集中研究了由Nanog所確定的轉(zhuǎn)錄機制，所述Nanog是已知在培養(yǎng)條件中沒有LIF 存在時維持小鼠ES細(xì)胞自我更新的基因。我們已經(jīng)在其C端定義了兩個潛在的轉(zhuǎn)錄激活域(Pan，G.和 Thomson，J.A.(2007)Cell?research?17(1)，42-49；Pan，G.，和Pei，D.(2005)J?Biol?chem.280(2)，1401-1407；Pan， G.J.，和Pei，D.Q.(2003)Cell?research?13(6)，499-502)。它們中之一是CD2或C端結(jié)構(gòu)域2，它們在基于Gal4 激活測定中已經(jīng)顯示為與病毒編碼的VP16一樣的能力。在此我們證明了在ES細(xì)胞沒有LIF的情況下 Nanog介導(dǎo)的自我更新需要CD2。另外，我們已經(jīng)揭示了CD2的轉(zhuǎn)錄激活活性和ES細(xì)胞自我更新所需要 的CD2中的一系列芳香氨基酸。

發(fā)明內(nèi)容：

在本發(fā)明中，發(fā)明人應(yīng)用了一種新的方法，將Nanog基因(序列見SEQ?ID?NO：1)的轉(zhuǎn)錄激活域CD2(序 列見SEQ?ID?NO：2)替換成了病毒中的一個已知更強有力的轉(zhuǎn)錄激活域VP16(序列見SEQ?ID?NO：3)，以 此來驗證CD2對于Nanog轉(zhuǎn)錄激活活性的作用。

令人驚訝的，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在CD2被替換成VP16，形成Nanog-VP16突變序列(SEQ?ID?NO：4)后， 不僅不能維持Nanog原有的維持胚胎干細(xì)胞自我更新能力的作用，而且會抑制內(nèi)源Nanog的表達，從而促 進細(xì)胞向各個方向的分化。使用我們所構(gòu)建的Nanog-VP16突變體，將有助于在抑制內(nèi)源Nanog蛋白質(zhì)(SEQ ID?NO：5)表達、促進細(xì)胞分化的基礎(chǔ)上研究Nanog的功能，并且研究胚胎干細(xì)胞分化的功能。

同時，在CD2被替換成VP16后，將使得Nanog對于其報告基因p5N(由SEQ?ID?NO：32(p5N正向 引物)和SEQ?IDNO：33(p5N反向引物)的序列退火形成5次重復(fù)，參見Pan，G.J.和Pei，D.Q.(2005)J?Biol Chem(280)(2)，1401-1407)的倍數(shù)激活高出幾十倍，使得用p5N作為報告基因檢測Nanog的活性更加明顯。 這使得在此基礎(chǔ)上研究Nanog的其它功能性結(jié)構(gòu)域更加便捷明顯。

附圖說明：