[發明專利]用VP16替代Nanog轉錄激活域CD2的Nanog基因突變體、攜帶其的載體,構建方法及其用途

有效

• 申請號: 200710032350.6
• 申請日: 2007-12-11
• 公開（公告）號: CN101457225A
• 公開（公告）日: 2009-06-17
• 發明（設計）人: 裴端卿;王哲;馬天驊
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C07K14/47;C12N5/06
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1.Nanog-VP16突變序列，其特征在于將編碼C端轉錄激活域2的核苷酸序列替換為編碼VP16轉錄激活域的核苷酸序列，所述Nanog-VP16突變序列如SEQID?NO：4所示。

2.權利要求1所述的突變序列所編碼的突變蛋白質，Nanog-VP16蛋白質，其特征在于氨基酸序列為SEQ?ID?NO：6。

3.包含權利要求1所述的突變序列的pPyCAGIP載體，其通過在所述載體的多克隆位點xhol和Notl之間插入PCR片段，所述PCR片段為權利要求1的突變序列。

4.在pCR3.1載體中構建權利要求1所述Nanog-VP16突變序列的方法，所述序列連接在pCR3.1的載體中，其包括步驟：

a.首先，用定點誘導突變的方法在Nanog-WR與Nanog-CD2間突變出一個kpnl限制性酶切位點，引物序列為SEQ?ID?NO：7和SEQ?ID?NO：8；

b.然后以kpnl?37℃處理4小時，在Nanog-WR和-CD2間切開，得到兩個3′末端突出的粘性末端片斷；

c.利用Kpnl3′-5′外切核酸酶的活性，37℃處理半小時，將Kpnl粘性末端切平，得到在WR和CD2這兩個結構域間切開的Nanog缺失CD2的突變中間體；

d.以VP16上下游引物特異性擴增VP16轉錄激活結構域片斷，所述VP16轉錄激活結構域片斷的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3，引物序列如SEQ?ID?NO：9和SEQ?ID?NO：10，在下游引物SEQ?ID?NO：10的3′端加入一個Notl酶切位點；

e.將此VP16片斷連入處理好的Nanog缺失CD2的突變中間體中，則可獲得以VP16轉錄激活結構域替換CD2的Nanog重組突變體，即Nanog-VP16突變序列。

5.權利要求1所述Nanog-VP16突變序列編碼的蛋白質的用途，其在轉染入小鼠胚胎干細胞促進小鼠胚胎干細胞的分化。

6.權利要求1所述Nanog-VP16突變序列編碼的蛋白質的用途，其作為工具與報告基因p5N一起用于研究Nanog蛋白質其它結構域的功能。?