[發明專利]一種基因微鏈載體及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 200710030825.8
• 申請日: 2007-10-12
• 公開（公告）號: CN101173294A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發明（設計）人: 杜軍;何玉文;王紅勝
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 林麗明

技術領域

本發明涉及基因載體技術領域，尤其是涉及一種基因微鏈載體及其構建方法和應用。

背景技術

目前，基因治療的難點是載體的轉染、表達效率低和存在安全隱患，安全有效的基因治療載體是現今基因治療研究領域的重點。基因治療載體的安全性問題使得開發出安全可靠、轉染效率高的載體成為現今基因治療研究領域的重點。

做為基因治療主要載體的病毒載體其局限性則是顯而易見：因為病毒型載體利用其自身感染程序將外源目的基因導入宿主細胞，故為維持該感染過程則需要完整病毒的參與。這些病毒成分在宿主細胞內復制極易引發機體產生不同程度的免疫反應，而且存在插入突變等致瘤、致毒風險。

非病毒載體在安全性方面可能優于病毒載體，雖然不會整合入宿主細胞染色體中，同時具有無傳染性、不限制載體容量、可大量制備等優點，但同樣能導致免疫反應，而且轉染效率不高。目前非病毒載體面臨兩大難題：首先，非病毒型載體是通過內吞方式將目的基因導入細胞，進入胞質的內吞小泡很快被溶酶體融合并被其釋放的各種酶系所降解。由此產生的后果將是嚴重影響目的基因的表達及其在基因治療中的實際用價值。其次，源于非宿主載體的DNA表達產物特別是CpG序列的大量存在可能引發宿主免疫反應。美國StanfordUniversity的Kay?MA等開發出幾乎不含非宿主DNA成分的微環DNA質粒(Minicircle?DNA?vectors)，但此種微環載體在轉染效率上尚顯不足。

所以人工合成具有穩定性、安全性和靶向性的非病毒載體的研究日益受到重視，比如構建新型微鏈載體，但如何有效地防止體內核酸外切酶的降解，增強微鏈載體在細胞內的穩定性、安全性是一個新的難題。

同時，載體的分子量要求更小，以便有利于從胞漿中進入到細胞核內表達，有效地提高在體細胞內的轉染效率。

MEKK1作為絲/蘇氨酸的蛋白激酶，位于信號傳導通路中的上游，將細胞外信號經級聯放大傳入細胞內。MEKK1介導的信號通過級聯放大直接作用于EB病毒自殺基因啟動子，誘導自殺基因的表達，使腫瘤細胞對抗癌藥物GCV敏感性增加數十倍。本申請人擬以其為靶點，通過導入具有活性的MEKK1基因激活EBV-TK基因表達調控系統，達到治療鼻咽癌等EB病毒相關腫瘤目的。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的空白，提供一種基因微鏈載體，轉染效率高，能有效地防止體內核酸外切酶的降解，在細胞內的穩定性、安全性較高。

本發明的另一個目的是提供所述的基因微鏈載體的構建方法，簡單易行，可靠性高。

本發明還有一個目的是提供所述基因微鏈載體的應用，通過裝載EB病毒膜蛋白LMP1的啟動子使得MEKK1基因只在EB病毒感染的細胞中進行表達以制備選擇性殺傷鼻咽癌細胞的藥物。

本發明的技術方案是提供一種基因微鏈載體，由線性DNA序列表達框和兩個對稱排列的Cap保護序列組成，所述Cap保護序列封閉線性DNA序列表達框兩端。

所述Cap保護序列進行修飾以構建不同的保護結構。

所述對Cap保護序列進行修飾是通過模擬真核生物細胞內tRNA相對穩定的c環結構，構建微鏈兩端穩定的Cap序列，分別在其兩端加上AseI、AflII酶切位點。

所述線性DNA序列為EGFP基因序列。

所述線性DNA序列為MEKK1基因序列。

本發明提供了所述EGFP基因微鏈載體的構建方法，包括以下步驟：

(1)模擬體內tRNA穩定C環的帽狀Cap構建；

(2)目的基因質粒的提取；

(3)基因表達框的獲得；

(4)目的基因表達框和Cap序列進行連接；

(5)微鏈載體的擴增、純化和保存。

提取pEGFP-N3質粒，37℃水浴條件下雙酶切pEGFP-N3質粒4h，采用1％的瓊脂糖凝膠膠回收1.6kb左右的片段；所述目的基因片段和兩端Cap采用摩爾比1∶10、16℃條件下進行連接，Ligation?High連接酶作用下連接30～60min或T4連接酶作用下過夜連接12～16h。

本發明提供了所述MEKK1基因微鏈載體的構建方法，包括以下步驟：

(1)B95-8培養和細胞收集，EBV的提取及EBV基因組DNA的提取，EBV膜蛋白LMP1啟動子的獲得；

(2)pCMV-MEKK1質粒的大量提取及MEKK1基因的獲得；

(3)XhoI酶切消化LMP1?Promoter及MEKK1基因并對其進行連接；