[發(fā)明專利]一種基因微鏈載體及其構建方法和應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710030825.8
• 申請日: 2007-10-12
• 公開（公告）號: CN101173294A
• 公開（公告）日: 2008-05-07
• 發(fā)明（設計）人: 杜軍;何玉文;王紅勝
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 林麗明

1.一種基因微鏈載體，其特征在于所述載體由線性DNA序列表達框和兩個對稱排列的Cap保護序列組成，所述Cap保護序列封閉線性DNA序列表達框兩端。

2.根據(jù)權利要求1所述的基因微鏈載體，其特征在于對Cap保護序列進行修飾以構建不同的保護結構。

3.根據(jù)權利要求2所述的基因微鏈載體，其特征在于所述對Cap保護序列進行修飾是通過模擬真核生物細胞內(nèi)tRNA相對穩(wěn)定的c環(huán)結構，構建微鏈兩端穩(wěn)定的Cap序列，分別在其兩端加上AseI、AflII酶切位點。

4.根據(jù)權利要求1所述的基因微鏈載體，其特征在于所述線性DNA序列為EGFP基因序列。

5.根據(jù)權利要求1所述的基因微鏈載體，其特征在于所述線性DNA序列為MEKK1基因序列。

6.一種權利要求1或4所述基因微鏈載體的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)模擬體內(nèi)tRNA穩(wěn)定C環(huán)的帽狀Cap構建；

(2)目的基因質粒的提取；

(3)基因表達框的獲得；

(4)目的基因表達框和Cap序列進行連接；

(5)微鏈載體的擴增、純化和保存。

7.根據(jù)權利要求6所述基因微鏈載體的構建方法，其特征在于提取pEGFP-N3質粒，37℃水浴條件下雙酶切pEGFP-N3質粒4h，采用1％的瓊脂糖凝膠膠回收1.6kb左右的片段；所述目的基因片段和兩端Cap采用摩爾比1∶10、16℃條件下進行連接，Ligation?High連接酶作用下連接30～60min或T4連接酶作用下過夜連接12～16h。

8.一種權利要求1或5所述基因微鏈載體的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)B95-8培養(yǎng)和細胞收集，EBV的提取及EBV基因組DNA的提取，EBV膜蛋白LMP1啟動子的獲得；

(2)pCMV-MEKK1質粒的大量提取及MEKK1基因的獲得；

(3)XhoI酶切消化LMP1?Promoter及MEKK1基因并對其進行連接；

(4)PCR擴增連接產(chǎn)物并利用AseI、AflII對連接產(chǎn)物進行消化；

(5)LMP1?promoter-MEKK1微鏈載體的構建和量化擴增；

(6)將LMP1?promoter-MEKK1目的條帶連上T載體并進行量化擴增；

(7)構建pEGFP-MEKK1質粒并進行量化擴增；

(8)將等量的pCMV-MEKK1質粒、MEKK1-T質粒、MEKK1微鏈載體轉染進入B95-8細胞；

(9)Western-blotting檢測pCMV-MEKK1質粒、MEKK1-T質粒、MEKK1微鏈載體在B95-8細胞內(nèi)MEKK1下游產(chǎn)物TK的表達。

9.一種權利要求5所述基因微鏈載體的應用，其特征在于通過裝載EB病毒膜蛋白LMP1的啟動子使得MEKK1基因只在EB病毒感染的細胞中進行表達以制備選擇性殺傷鼻咽癌細胞的藥物。