[發(fā)明專利]一種新的重組蛇毒金屬蛋白酶的表達(dá)、復(fù)性及其生物學(xué)活性

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710030709.6
• 申請(qǐng)日: 2007-09-30
• 公開（公告）號(hào): CN101397567A
• 公開（公告）日: 2009-04-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 向開軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 向開軍
• 主分類號(hào): C12N15/57
• 分類號(hào): C12N15/57;C12N9/64
• 代理公司: 廣州市深研專利事務(wù)所
• 代理人: 陳雅平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組蛇毒金屬蛋白酶基因的構(gòu)建、表達(dá)以及該重組蛇 毒金屬蛋白酶的體外復(fù)性和活性測(cè)定。

背景技術(shù)

蛇毒中含有很多具有生物學(xué)活性和醫(yī)藥及工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的蛋白酶類。其 中，蛇毒金屬蛋白酶是主要組份之一。它常常是蝮蛇蛇毒的主要毒素，引起 被咬機(jī)體的局部或系統(tǒng)出血。由于蛇毒金屬蛋白酶是一種蛋白酶，所以，與 其他工業(yè)用蛋白酶一樣，它也具有潛在的和現(xiàn)實(shí)的醫(yī)藥和工業(yè)用價(jià)值。如蛇 毒降纖酶就是從蛇毒中分離得到的一種蛋白酶，目前已應(yīng)用于人體血栓的臨 床治療中。此外，國外科學(xué)家試驗(yàn)表明，蛇毒蛋白酶還可去除衣物污漬。但 是，由于天然蛇毒的來源有限，品種資源的日益減少以及分離純化的繁瑣和 困難，因此，通過基因工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)創(chuàng)造新的蛋白酶品種，以及通 過發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白酶就具有特別重要的意義。

目前，通過基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白已成為分子生物學(xué) 中的常規(guī)技術(shù)。但是，很多蛋白酶，尤其是含有多個(gè)二硫鍵的蛋白酶在大腸 桿菌中表達(dá)后往往形成沒有生物學(xué)活性的不溶性的包涵體；經(jīng)體外復(fù)性后， 很多蛋白酶還是沒有生物學(xué)活性。為了繞過沒有生物學(xué)活性的包涵體這個(gè)難 關(guān)，人們常常利用酵母和動(dòng)物細(xì)胞來生產(chǎn)或表達(dá)真核蛋白。但是，利用酵母 和動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的成本很高，表達(dá)量相對(duì)較低，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，分 離純化的難度相對(duì)較大，操作技術(shù)也更復(fù)雜，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。另外，有 些毒性蛋白不適合于在動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)，而更易于在大腸桿菌中以包涵體的 形式大量表達(dá)。因此，若能使在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白酶 復(fù)性后仍具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，那么，在大腸桿菌中生產(chǎn)重組蛋白酶就具 有極大的成本優(yōu)勢(shì)和大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明利用已公開發(fā)表的巴西非出血蛇毒金屬蛋白酶成熟酶區(qū)cDNA序 列和中國皖南尖吻蝮蛇出血蛇毒金屬蛋白酶acutolysin?A(該酶的名稱)的 成熟酶區(qū)cDNA序列為材料，構(gòu)建了一種自然界不存在的重組金屬蛋白酶基 因，并在大腸桿菌中高效表達(dá)了該蛋白酶。經(jīng)體外復(fù)性后，該蛋白酶具有明 顯的蛋白水解活性。

巴西蛇毒金屬蛋白酶基因序列的參考文獻(xiàn)：

1，Selistre?de?Araujo?H.S.&?Ownby?C.L.(1995)Molecular?cloning?and?sequence?analysis?of cDNAs?for?metalloproteinases?from?broad-banded?copperhead?Agkistrodon?contortrixlaticinctus. Arch.Biochem.Biophys.320，141-148.

2，Selistre?de?Araujo?H.S.，de?Souza?E.L.，Beltramini，L.M.，Ownby，C.L.&?Souza，D.H.(2000) Expression，refolding，and?activity?of?a?recombinant?nonhemorrhagic?snake?venom metalloprotease.Protein?Expr.&?Purif.19，41-47.

中國皖南尖吻蝮蛇出血毒金屬蛋白酶acutolysin?A(該酶的名稱)的 成熟酶區(qū)cDNA序列參考文獻(xiàn)：

1，Liu，Q.，Xu，W.，Cheng，X.，Jin，G.，Shen，X.，Lou，H.&?Liu，J.(1999)Molecular?cloning and?sequence?analysis?of?cDNA?encoding?hemorrhagic?toxin?acutolysin?A?from?Agkistrodon acutus.Toxicon?37，1539-1548.

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述不足之處和開發(fā)新的工業(yè)用或醫(yī)藥用蛋白酶，本發(fā)明構(gòu)建 了一種新的重組或嵌合蛇毒金屬蛋白酶基因，并在大腸桿菌中以包涵體的形 式表達(dá)了該重組金屬蛋白酶，經(jīng)體外復(fù)性后，該重組蛋白酶具有對(duì)多種蛋白 底物的水解活性。