[發明專利]變形桿菌檢測用引物、檢測方法、檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200710030438.4
• 申請日: 2007-09-21
• 公開（公告）號: CN101153328A
• 公開（公告）日: 2008-04-02
• 發明（設計）人: 魏泉德;張彩虹;譚愛軍;張麗榮
• 申請（專利權）人: 珠海市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人: 楊煥軍

1.一種變形桿菌檢測用引物，其特征在于，能擴增靶基因的特異堿基序列，所述靶基因為變形桿菌的ureR---GenBank登陸號：Z18752，所述引物與所述靶基因的586位---810位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。

2.一種變形桿菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成：

正向外引物F3-ure????GGTGAGATTTGTATTAATGGGC

反向外引物B3-ure????ATAATCTGGAAGATGACGAGTA

正向內引物FIP-ure

TGTCACATCACAAGAAACTTGACTAAAACTATCACAGTCACCACTA

反向內引物BIP-ure

TTCCCGACCAAACCGATTGAATTATAATGGTTTGAGTAAAGAGAACAC可以擴增變形桿菌的ureR基因序列的586位---810位的核酸序列的一部分或其互補鏈。

3.根據權利要求2所述的一種變形桿菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組可以擴增變形桿菌的如下片斷或互補鏈：

所述正向外引物F3：擴增始于586-607bp；

所述正向內引物FIP：擴增始于654-678bp的互補序列和608-628bp；

所述反向外引物B3：擴增始于789-810bp的互補序列；

所述反向內引物BIP：擴增始于685-708bp，和745-768bp的互補序列。

4.一種變形桿菌的檢測方法，該方法用于檢測標本中是否存在變形桿菌，其特征在于，以變形桿菌的ureR基因序列的586位---810位的核酸序列的一部分或其互補鏈為靶，通過LAMP法用上述引物組選擇性擴增上述靶區域，確認是否存在有擴增產物。

5.根據權利要求4所述的一種變形桿菌的檢測方法，其特征在于，具體檢測方法為：

1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品、糞便、嘔吐物等標本；細菌待檢標本用相應腸道增菌液增菌培養8-12小時后，取1.0ml增菌液10000rpm離心2分鐘，棄其上清液后，用DNA提取試劑盒提取模板DNA或加20～30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul上清液做待檢模板DNA；

2)變形桿菌的環介導等溫擴增

取擴增反應液，先加待檢模板，再加酶，最后加雙蒸水，形成如下總體積為20ul～100ul的反應體系，混勻點離后在約60-65℃條件下恒溫保溫約60-90分鐘，然后置于80℃的環境下2分鐘滅活酶。

反應總體積20ul～100ul的反應體系為：

??成分??終濃度或量??待檢模板??核酸模板??1-10ul???擴??增??反??應??液??正向內引物FIP-ure??反向內引物BIP-ure??正向外引物F3-ure??反向外引物B3-ure??甜菜堿betaine??dNTP??mgsO₄??反應緩沖液Bst?DNA?Polymerase?Buffer?10×??1.0-2.0uM??1.0-2.0uM??0.15-0.3uM??0.15-0.3uM??0.8-1.5M??1.0-1.6mM??2-6mM??1/10反應體積(ul?)??酶??Bst?DNA?Polymerase??0.16-0.64U/ul??雙蒸水??ddH₂O??加至預定反應體積(ul)

其中10×Bst?DNA?Polymerase?Buffer反應緩沖液含有200mM?pH?8.8的三羥基甲硫氨酸甲烷-鹽酸(Tris-Hcl)、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％曲拉通X-100；

所述酶為每微升含8-16個活性單位的Bst?DNA酶。。

3)LAMP反應產物的檢測：

A)肉眼檢測：與陰性對照管比較顯示，檢測管出現明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性；或，

B)加染料后檢測：每25ul體系的反應管加1000×SYBR?Green?I?invitrogen1-2ul，1-5分鐘觀察結果，反應液變綠為陽性，保持無色或棕色為陰性；或，

C)電泳檢測：2-3％瓊脂糖凝膠，70V電泳約60-100分鐘，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀條帶，最小片段在160bp左右，則結果為陽性；如無任何條帶則結果為陰性。