[發明專利]變形桿菌檢測用引物、檢測方法、檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200710030438.4
• 申請日: 2007-09-21
• 公開（公告）號: CN101153328A
• 公開（公告）日: 2008-04-02
• 發明（設計）人: 魏泉德;張彩虹;譚愛軍;張麗榮
• 申請（專利權）人: 珠海市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人: 楊煥軍

技術領域

本發明涉及一種基于環介導等溫擴增(loop-mediated?isothermalamplification，LAMP)技術的食源性病原體快速檢測技術。特別涉及對變形桿菌特定基因片段具有特異性的引物及引物組；還涉及將所述引物及引物組用環介導等溫擴增法檢測變形桿菌的檢測方法和檢測試劑盒。

背景技術

食源性疾病發病率較高，由沙門氏菌，志賀氏菌，金黃色葡萄球菌，變形桿菌，霍亂弧菌，副溶血性弧菌以及E.coli?O157:H7，輪狀病毒以及諾如病毒引起的食物中毒，其發病率在我國食源性疾病發病率中占非常高的比例，是一個嚴重的公共衛生問題。

目前對食源性病原體的檢測主要依靠病原體分離法、免疫學方法和各種PCR方法。病原體分離雖然是金標準，但繁瑣費時，一般需要5天時間，最長需要一個月時間，而且免疫學方法的特異性和敏感性均較低。

隨著分子生物學技術的發展，人們采用PCR技術應用于細菌的診斷。例如PCR中國專利公開號CN1526825的專利申請，批露了一種利用副溶血性弧菌PR72H序列的特異性，通過DNA提取、PCR擴增、電泳觀察等分子生物學手段檢測副溶血性弧菌的方法。雖然該方法敏感、準確、快速，但由于需要昂貴的儀器設備、較高檢測費用以及對檢測人員較高的技術要求而使其不適用于現場快速檢測及基層普及應用。

環介導等溫擴增(loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP)技術(國際專利公開號WO?00/28082)是2000年Notomi等開發出一種核酸擴增新技術，即針對靶基因的6個區域設計4條特異引物(如有需要還可以添加有環引物對)，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst?DNA?polymerase)在65℃左右恒溫條件保溫約60分鐘，即可完成核酸擴增反應，擴增結果可直接對擴增副產物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進行判斷或者對其濁度進行檢測，也可用結合雙鏈DNA的熒光染料SYBR?Green?I染色，通過肉眼進行判定。用于LAMP技術擴增的2對引物乃針對基因6個區段，因而具有比PCR更高的特異性，同時也具備不需要熱循環、其單位時間內擴增效率更高、且不需特殊儀器等優點。但是目前未有利用環介導等溫擴增法檢測變形桿菌的檢測方法和檢測試劑盒，以及對變形桿菌特定基因片段具有特異性的LAMP引物組的報道。

發明內容

本發明的一個目的在于，提供一種對變形桿菌特定基因片段具有特異性的引物。

上述目的是通過如下技術方案實現的：

一種變形桿菌檢測用引物，其特征在于，能擴增靶基因的特異堿基序列，所述靶基因為變形桿菌的ureR---GenBank登陸號：Z18752，所述引物與所述靶基因的586位---810位的核酸序列的一部分或其互補鏈互補。

本發明的另一個目的在于，提供一種對變形桿菌特定基因片段具有特異性的引物組。

上述目的是通過如下技術方案實現的：

一種變形桿菌檢測用引物組，其特征在于，所述引物組由下列引物組成：

正向外引物F3-ure????GGTGAGATTTGTATTAATGGGC

反向外引物B3-ure????ATAATCTGGAAGATGACGAGTA

正向內引物FIP-ure

TGTCACATCACAAGAAACTTGACTAAAACTATCACAGTCACCACTA

反向內引物BIP-ure

TTCCCGACCAAACCGATTGAATTATAATGGTTTGAGTAAAGAGAACAC

可以擴增變形桿菌的ureR(Z18752)基因序列的586位---810位的核酸序列的一部分或其互補鏈。

本發明的另一個目的在于，提供一種利用上述引物組的基于環介導等溫擴增法檢測變形桿菌的檢測方法。

上述目的是通過如下技術方案實現的：

一種變形桿菌的檢測方法，該方法用于檢測標本中是否存在變形桿菌，其特征在于，以變形桿菌的ureR(Z18752)基因序列的586位---810位的核酸序列的一部分或其互補鏈為靶，通過LAMP法用上述引物組選擇性擴增上述靶區域，確認是否存在有擴增產物。

具體檢測方法為：

1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于食品樣品、糞便、嘔吐物等標本；細菌待檢標本用相應腸道增菌液增菌培養8-12小時后，取1.0ml增菌液10000rpm離心2分鐘，棄其上清液后，用DNA提取試劑盒提取模板DNA或加20～30ul三蒸水煮沸5分鐘，再取2ul上清液做待檢模板DNA；