[發明專利]基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白及制備

無效

• 申請號: 200710028037.5
• 申請日: 2007-05-11
• 公開（公告）號: CN101302255A
• 公開（公告）日: 2008-11-12
• 發明（設計）人: 黃迪南;侯敢
• 申請（專利權）人: 廣東醫學院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C12N15/62
• 代理公司: 湛江市三強專利事務所
• 代理人: 龐愛英

技術領域

本發明涉及基因工程蛋白質藥物領域，更具體地，本發明涉及基質金屬蛋白酶導向性重組人腫瘤壞死因子融合蛋白及其制備方法，這些融合蛋白的氨基酸序列由三部分組成：從N-端開始依次為膠原蛋白序列、(一種或一類)人基質金屬蛋白酶底物序列和人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)序列，進一步涉及這些融合蛋白基因、工程菌、融合蛋白在原核細胞中的表達、融合蛋白的分離純化，以及對惡性腫瘤細胞具有靶向作用和特異殺傷作用的證據。?

背景技術

惡性腫瘤是對人類健康與生命危害最大的疾病之一。隨著腫瘤免疫學、分子生物學和基因工程技術的飛速發展，細胞因子療法成為抗腫瘤的分子治療學研究熱點。而利用生物工程技術在分子水平改造細胞因子結構以增強其抗瘤活性和降低毒性的有效探索，有望為細胞因子治療腫瘤開辟一條新的途徑。?

1.腫瘤壞死因子的研究進展?

腫瘤壞死因子(tumor?necrosis?factor，TNF)是一種多功能細胞因子，具有廣泛的生物活性，參與機體的免疫調節和抗腫瘤作用，它是迄今為止發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子。?

(1)腫瘤壞死因子的生物學功能?

TNF自1975年發現以來，一直受到世界各國學者的重視。TNF有TNF-α和TNF-β兩種類型。前者又被稱為惡病質素，主要由單核巨噬細胞產生；后者又被稱作淋巴細胞毒素，由活化的淋巴細胞產生。1984年獲得了人TNF-?α的cDNA克隆并在大腸桿菌中成功表達。在此基礎上人們對TNF的理化性質、生物活性及臨床應用進行了廣泛研究。TNF具有廣泛的生物活性，其最顯著特征是在體內外能特異性地直接殺傷腫瘤細胞，TNF的抗腫瘤作用主要是由于：①TNF為激發性細胞因子，可啟動廣泛的免疫炎性反應，介導天然細胞毒細胞、單核細胞和巨噬細胞對癌細胞的殺傷和溶瘤作用；②TNF可作用于血管內皮細胞，使腫瘤的血管變形受損或形成血栓，導致腫瘤發生出血性壞死或因營養缺乏而消退；③TNF可通過誘導某些腫瘤細胞凋亡來抑制癌細胞增生。?

由于其廣泛的抗腫瘤作用和免疫調節作用，故TNF-α治療腫瘤的動物實驗和臨床研究已在許多國家進行，美國FDA早在1984年就批準用TNF-α治療腫瘤的臨床試驗。動物實驗和臨床研究表明，TNF-α對神經纖維瘤、肺癌、乳腺癌、肌肉瘤和淋巴瘤等腫瘤細胞具有明顯的殺傷作用。但是，由于TNF-α的毒副作用大而嚴重限制了其臨床應用，毒副作用包括發熱、頭痛、惡心、嘔吐、全身倦怠和肌肉酸痛等癥狀，大劑量使用可導至嚴重的低血壓、休克、DIC形成甚至死亡。TNF-α的上述缺陷，為其直接進入臨床應用造成了很大困難。但考慮到TNF-α是迄今為止發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子，因此，人們一直在努力開發其潛能。降低TNF-α的毒副作用和增強腫瘤靶向性是解決這一難題的兩個關鍵。?

(2)腫瘤壞死因子分子結構與作用機制?

人TNF-α基因定位于人類第6號染色體上，與HLA基因連鎖。編碼產物先是由233個氨基酸殘基組成的前體，含有一段由76個氨基酸殘基組成的信號肽，切除信號肽后轉化成成熟的TNF-α，其分子量為17kD，含157個氨基酸殘基，無糖基化位點，第69位的cys和第101位的cys形成分子內二硫健。人TNF-α的活性形式是由三個17kD亞基以同源三聚體的形式存在，每個亞基通過β折疊以邊對面的堆積方式形成的外觀近似金字塔(三角錐)的三聚體分子。TNF-α的各種生物學效應是通過與靶細胞膜上的TNF受體結合而產生的，其受體存在于多種正常細胞及腫瘤細胞表面，分為兩種類型：TNFR1和TNFR2。TNF-α與兩種受體的結合并無特異性，其受體結合部位位于金字塔的底部，N末端的(7個)氨基酸序列游離于底部并且可?能影響其與受體的結合。TNFR1胞內結構域中含有一個約90個氨基酸組成的“死亡域”(death?domain，DD)，而TNFR2沒有。TNFR1產生的信號介導細胞凋亡和通過激活核轉錄因子NF-κB而使細胞增殖、分化；TNFR2則通過不同于TNFR1，但在某些環節可發生交叉反應的信號傳導途徑激活NF-κ?B，使細胞增殖和分化。?

(3)腫瘤壞死因子融合蛋白的研究進展?