[發(fā)明專利]一種利用親和層析法分離純化纖溶酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710027907.7
• 申請日: 2007-04-30
• 公開（公告）號: CN101067131A
• 公開（公告）日: 2007-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭勇;崔堂兵;劉柳
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;B01D15/08
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 何淑珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及治療栓塞性疾病的纖溶酶的分離純化技術(shù)，具體涉及一種利用親和層析法分離純化纖溶酶的方法。

背景技術(shù)

栓塞性疾病嚴(yán)重地危害著人類的生命健康，尤其是心腦血管栓塞性疾病是危害中老年人健康最嚴(yán)重而又常見的疾病之一。血栓癥日漸成為死亡率占首位的病癥，溶解血栓是治療這一類疾病的重要手段。因此，對溶栓藥物的研究已被廣為重視，當(dāng)今用于臨床治療的藥物包括鏈激酶(Streptokinase；SK)、尿激酶(Urokinase；UK)、組織型血纖溶酶原激活劑(Tissue?Plasminogen?Activator；tPA)等。正在研究開發(fā)的纖溶酶有納豆激酶、豆豉纖溶酶等。

纖溶酶是一類催化血纖維蛋白水解的蛋白酶，是防治血栓性疾病的有效藥物，可以通過微生物發(fā)酵或者從含有纖溶酶的動物，植物或微生物原料中提取獲得。

從發(fā)酵液或者粗酶液中分離純化纖溶酶是研究開發(fā)溶栓藥物的重要環(huán)節(jié)。目前纖溶酶的分離純化主要是運(yùn)用鹽析、膜分離、離子交換層析，凝膠過濾層析和疏水層析等方法。這些都存在工藝路線長、回收率低(一般僅10％-40％)、操作復(fù)雜等不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種只需親和層析一步就可以分離得到電泳純的產(chǎn)品，分離純化效率高，酶回收率達(dá)到70％以上的利用親和層析分離純化纖溶酶的方法。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種利用親和層析分離純化纖溶酶的方法，包括如下步驟和工藝條件：

(1)親和層析介質(zhì)的制備，包括如下步驟：

a.將人血纖維蛋白原以50～100mg/mL濃度溶于無菌水中，35～40℃保溫直至完全溶解；

b.將瓊脂糖溶于pH7.6～8.2的巴比妥納-HCl緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度為1.2～1.8％的溶液，滅菌后冷卻至48～52℃；

c.將步驟b配置的溶液與步驟a已經(jīng)溶解的纖維蛋白原溶液混合，加入4～10IU/mL的人凝血酶，混合均勻，保溫20～40分鐘；

d.將步驟c的混合液用注射器滴入預(yù)冷至2～10℃的四氯乙烯中，制成球形顆粒；

e.取出球形顆粒，用無離子水清洗，于35～40℃保溫1～2h；

f.加入質(zhì)量濃度為3～5％的戊二醛作為交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)固定，用無離子水清洗后于2～10℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)親和層析：

將步驟f制備好的親和層析介質(zhì)裝進(jìn)層析柱；在溫度為2-10℃的條件下，用pH7.6～8.0的緩沖液平衡層析柱，再加入樣品液；然后用pH7.6～8.0的緩沖液沖洗，去除雜質(zhì)；最后用pH5.2～5.8的洗脫液洗脫，收集洗脫液。

為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，所述步驟e優(yōu)選在37℃條件下保溫1～2h。所述步驟(2)優(yōu)選在溫度為4～6℃的條件下進(jìn)行親和層析操作。

本發(fā)明原理：制備親和層析介質(zhì)，用親和層析法分離純化纖溶酶；該方法利用纖溶酶與其作用底物血纖維蛋白之間的專一又可逆的親和力，使纖溶酶與雜質(zhì)分離的方法。

技術(shù)線路為：去除菌體后的纖溶酶發(fā)酵液(或纖溶酶粗酶液)→親和層析→得到電泳純的纖溶酶。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)傳統(tǒng)的分離純化方法工藝路線長，一般樣品要經(jīng)過兩三次甚至更多次層析柱才能達(dá)到電泳純，分離時間較長、回收率較低而且操作過程繁瑣復(fù)雜。而本發(fā)明采用粗酶液或去除菌體后的發(fā)酵液，只需通過一次親和層析便可分離得到所需要的纖溶酶，而且親和層析介質(zhì)可以反復(fù)使用，也可以根據(jù)需要進(jìn)行放大，大大提高了酶的回收率和純度，節(jié)約了時間和人力。

(2)該方法工藝過程簡單，分離純化效率高，酶回收率達(dá)到70％以上。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，發(fā)明人對本發(fā)明經(jīng)過研究和試驗(yàn)，有許多成功的實(shí)例，下面列舉部分具體實(shí)施例，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。

實(shí)施例1

用親和層析法分離純化鈉豆激酶發(fā)酵液，包括如下步驟和工藝條件：

(1)親和層析介質(zhì)的制備：

a將人血纖維蛋白原100mg溶于2mL無菌水中，配置成濃度為50mg/mL的血纖維蛋白原溶液，37℃保溫15-30分鐘，至完全溶解；

b將300mg瓊脂糖溶于20mL?pH7.8的40mmol/L巴比妥納-HCl緩沖液中，配制成質(zhì)量濃度為1.5％的溶液，滅菌后冷卻至50℃；

c將步驟a和步驟b配置的溶液混合，再加入5IU/mL的人凝血酶，混合均勻，保溫30分鐘；