[發(fā)明專利]肺炎鏈球菌自溶酶蛋白及其原核表達(dá)純化工藝和疫苗

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710027897.7
• 申請(qǐng)日: 2007-04-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101063116A
• 公開(kāi)（公告）日: 2007-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳忠道;鮮墨;甘慧泉;袁竹青;余新炳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/36
• 分類號(hào): C12N9/36;C07K14/315;C07K7/08;C07K7/06;C12N15/31;C07K19/00;A61K39/09;A61P11/00
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司
• 代理人: 劉孟斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種有抗原性以及免疫原性肺炎鏈球菌自溶酶蛋白，制備肺炎鏈球菌自溶酶蛋白的原核表達(dá)純化工藝，包含這種蛋白的疫苗，以及它在預(yù)防肺炎鏈球菌感染中的應(yīng)用和給予免疫主體新的免疫途徑。本發(fā)明所涉及的技術(shù)主要是分子生物學(xué)以及基因工程相關(guān)技術(shù)。在針對(duì)該疫苗的保護(hù)性效果評(píng)價(jià)中，還涉及到藥效學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)相關(guān)技術(shù)。另外，在針對(duì)免疫主體的免疫保護(hù)性研究當(dāng)中，還涉及到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本發(fā)明是以分子生物學(xué)技術(shù)和生物制藥技術(shù)為依托，在生物制藥技術(shù)領(lǐng)域的一項(xiàng)創(chuàng)新。

背景技術(shù)

由肺炎鏈球菌所引起的細(xì)菌性肺炎以及呼吸道感染是威脅人類健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病。作為一種條件致病菌，它在正常條件下寄生于人體的呼吸道。約40％-50％健康人群攜帶有肺炎鏈球菌。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，如麻疹等呼吸道病毒感染以后，營(yíng)養(yǎng)不良或者老年體弱等情況下，肺炎鏈球菌將透過(guò)黏膜防御體系，從黏附部位下行至肺或者進(jìn)入血液引起細(xì)菌性肺炎，以及中耳炎、菌血癥、腦膜炎等相關(guān)疾病。肺炎鏈球菌也是發(fā)達(dá)國(guó)家及發(fā)展中國(guó)家引起兒童及成人細(xì)菌性肺炎的主要致病菌。在發(fā)展中國(guó)家，每年有500萬(wàn)5歲以下的兒童死于肺炎鏈球菌所引起的肺炎，10-50萬(wàn)兒童死于肺炎鏈球菌所引起腦膜炎。與其他細(xì)菌相比，肺炎鏈球菌因其侵襲性更容易造成老年人、兒童及部分成人死亡，占世界疾病死因的第15位。目前已有的肺炎鏈球菌多糖疫苗由于其免疫原性較弱，不能有效的被機(jī)體識(shí)別并產(chǎn)生有效的抗體。尤其對(duì)高危人群(＜2歲或＞60歲)的保護(hù)性較差。更為嚴(yán)重的是，肺炎鏈球菌對(duì)各種抗生素的耐藥性有逐漸升高的趨勢(shì)，給治療和預(yù)防帶來(lái)諸多困難。

對(duì)此可行的方法之一就是發(fā)展并利用新的特殊疫苗。除了當(dāng)前廣泛應(yīng)用的23價(jià)多糖疫苗外，幾種莢膜蛋白結(jié)合疫苗作為候選疫苗正在試驗(yàn)當(dāng)中。包括VitB成分結(jié)合蛋白如PspA、肺炎球菌溶血素的衍生毒素、神經(jīng)氨酸酶及透性酶PsaA。

自美國(guó)于1977年研制出14價(jià)多糖疫苗起(Fedson?DS，pneumococcal?vaccine.In：PlotkinSA.Vaccines?Philadelphia，Pa：WB?Saunderss?Co-1988，271-299)，多糖疫苗的一直被認(rèn)為是抗肺炎鏈球菌的有效武器。目前廣泛應(yīng)用地23價(jià)莢膜多糖疫苗(楊耀，23價(jià)肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗的研制，中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2000，13(3)：154-156)仍然具有局限性。由于多糖成分屬于胸腺非依賴性抗原，只能引起體液免疫應(yīng)答，且只能產(chǎn)生IgM類抗體，不產(chǎn)生免疫記憶。另一方面，23價(jià)多糖疫苗僅對(duì)100多種不同血清型的肺炎鏈球菌中的23種有效。

而肺炎鏈球結(jié)合疫苗可克服以上缺點(diǎn)。嬰幼兒肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗的繼發(fā)免疫反應(yīng)具有T細(xì)胞依賴的特點(diǎn)。由于多價(jià)結(jié)合疫苗蛋白組份可能競(jìng)爭(zhēng)數(shù)量有限的載體特異性T細(xì)胞，增加結(jié)合疫苗的價(jià)較為困難。使用單一載體蛋白可能導(dǎo)致載體的超負(fù)荷，并且由于缺乏足夠的載體特異性T輔助細(xì)胞而降低免疫反應(yīng)。2000年荷蘭研究人員用破傷風(fēng)和白喉類毒素作載體的11價(jià)肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗在健康嬰幼兒的耐受性和免疫原性，并觀察鋁佐劑對(duì)疫苗安全性和免疫原性的影響(Pediatr?Infect?Dis?J?2000，20：272)。我國(guó)蔣曉東等人于2005年研制出針對(duì)我國(guó)肺炎鏈球菌型別多價(jià)肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗，并已經(jīng)申請(qǐng)專利(申請(qǐng)專利號(hào)：03141407.9)。

盡管多糖蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗是對(duì)肺炎鏈球菌感染治療的一種突破，但目前國(guó)內(nèi)外使用的結(jié)合疫苗的蛋白載體均是白喉或破傷風(fēng)類毒素。也有使用腦膜炎球菌外膜蛋白的。這類結(jié)合疫苗容易與其他疫苗如白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗產(chǎn)生沖突。而且多價(jià)結(jié)合疫苗蛋白組份可能競(jìng)爭(zhēng)數(shù)量有限的載體特異性T細(xì)胞，使進(jìn)一步增加結(jié)合疫苗的價(jià)變的非常困難。因此發(fā)展新一代肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)疫苗及其新的多糖結(jié)合載體成為趨勢(shì)。肺炎鏈球菌本身的蛋白，如自溶酶、PspA、肺炎球菌溶血素、PsaA及PspC有望作為新的蛋白質(zhì)疫苗及結(jié)合多糖的首選載體。使用這類蛋白可避免與其他如白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗產(chǎn)生沖突；其自身蛋白可以在免疫上對(duì)多糖起到補(bǔ)充作用，從而增強(qiáng)免疫保護(hù)作用；可提高對(duì)以后肺炎鏈球菌感染的免疫記憶應(yīng)答。

與莢膜多糖的高度異型性相比，自溶酶蛋白是肺炎鏈球菌的一種相當(dāng)保守的蛋白成分，在不同血清型肺炎鏈球菌中的同源性非常高。因此少數(shù)幾種具有免疫保護(hù)效應(yīng)的自溶酶蛋白有望對(duì)幾乎所有血清型的肺炎鏈球菌產(chǎn)生抵抗作用。另外，它屬于胸腺依賴性抗原，既能引起體液免疫應(yīng)答也能引起細(xì)胞免疫應(yīng)答，可產(chǎn)生IgG等多種類別的抗體，可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫記憶，有望對(duì)不同年齡層次的人群均可產(chǎn)生保護(hù)作用。