[發(fā)明專(zhuān)利]肺炎鏈球菌自溶酶蛋白及其原核表達(dá)純化工藝和疫苗無(wú)效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 200710027897.7 | 申請(qǐng)日： | 2007-04-30 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN101063116A | 公開(kāi)（公告）日： | 2007-10-31 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 吳忠道;鮮墨;甘慧泉;袁竹青;余新炳 | 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人： | 中山大學(xué) |
| 主分類(lèi)號(hào)： | C12N9/36 | 分類(lèi)號(hào)： | C12N9/36;C07K14/315;C07K7/08;C07K7/06;C12N15/31;C07K19/00;A61K39/09;A61P11/00 |
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| 地址： | 510080廣東省廣州*** | 國(guó)省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 肺炎 鏈球菌 蛋白 及其 表達(dá) 純化 工藝 疫苗 | ||
1.一種肺炎鏈球菌自溶酶蛋白，它具有如下特征：①SDS-PAGE分析其分子量為34KDa左右；②來(lái)源于23F、19F、6A、6B或14血清型肺炎鏈球菌，是肺炎鏈球菌自身蛋白質(zhì)的一種；③在原核表達(dá)中的表達(dá)形式可以是可溶性表達(dá)或包涵體表達(dá)。
2.一種制備肺炎鏈球菌自溶酶蛋白的原核表達(dá)純化工藝，它包括制備蛋白及其肽段或衍生物所需要的表達(dá)方式、發(fā)酵方式、制備流程、表達(dá)純化的優(yōu)化條件，其中表達(dá)方式為可溶性表達(dá)；表達(dá)純化優(yōu)化的條件包括以L(fǎng)B培養(yǎng)基為培養(yǎng)基，其PH值為6.4-PH?7.0；培養(yǎng)誘導(dǎo)溫度為25℃；誘導(dǎo)時(shí)間為1.5至2小時(shí)；表達(dá)過(guò)程中接種量為1％的接種量；裝液量為30％-40％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述表達(dá)純化工藝，其特征在于發(fā)酵方式為搖瓶發(fā)酵表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述表達(dá)純化工藝，其特征在于在該蛋白的純化過(guò)程中，以中性PBS為蛋白質(zhì)的溶劑，將緩沖液為中性PBS，PH值為7.0的親和層析柱作為純化工具，以保持所得到蛋白質(zhì)的活性不變；純化流程中，結(jié)合蛋白質(zhì)可溶性表達(dá)的特點(diǎn)，采用超聲與凍融的物理方式破碎工程菌。
5.一種來(lái)源于權(quán)利要求1所定義蛋白質(zhì)的重組抗原表位肽段，其特征在于該重組抗原表位包括：
一個(gè)B細(xì)胞抗原表位，即氨基酸序列2～28(EINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHST)；
一個(gè)T細(xì)胞抗原表位，即氨基酸序列98～112(FMTDYRLYIELLRNL)；
一個(gè)柔性肽段，即(GLY-GLY-GLY-GLY-SER)3，該柔性肽段位于兩個(gè)抗原表位之間。
6.一種如權(quán)利要求5所述重組抗原表位的分子克隆構(gòu)建方法，包括：
以PCR擴(kuò)增得到抗原表位的基因編碼序列，基因序列為
ATG?GAA?ATT?AAT?GTG?AGT?AAA?TTA?AGA?ACA?GAT?TTG?CCT?CAA?GTC?GGC?GTG?CAA?CCA?TAT?AGG
CAA?GTA?CAC?GCA?CAC?TCA?ACT?GGT?GGC?GGT?GGC?TCA?GGT?GGC?GGT?GGA?TCC?GGC?GGT?GGC?GGT
TCG?TTC?ATG?ACG?GAC?TAC?CGC?CTT?TAT?ATC?GAA?CTC?TTA?CGC?AAT?CTA?TAG
其中黑體為插入的柔性肽編碼基因序列，柔性肽前端為B細(xì)胞抗原表位編碼序列，后端為T(mén)細(xì)胞抗原表位編碼基因序列，ATG為加上的起始密碼子，TAG為加上的終止密碼子；
②三段肽段的連接采用酶切和DNA連接酶催化反應(yīng)方法，并將從抗原表位的起始氨基酸開(kāi)始第37，從柔性肽的起始氨基酸開(kāi)始第9個(gè)氨基酸Gly的密碼子第三個(gè)堿基由C替換為A；將從抗原表位的起始氨基酸開(kāi)始第38，從柔性肽的起始氨基酸開(kāi)始第10個(gè)氨基酸Ser的密碼子第三個(gè)堿基由G替換為C；
③利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建的重組抗原表位為一個(gè)新的由三個(gè)肽段構(gòu)成的人工重組小分子蛋白質(zhì)，該小分子蛋白氨基酸序列為EINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHST-(GLY-GLY-GLY-GLY-SER)3-FMTDYRLYIELLRNL。
7.一種以權(quán)利要求1所定義蛋白質(zhì)制備的抗肺炎鏈球菌感染疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述疫苗，其特征是疫苗的主要成分肺炎鏈球菌自溶酶蛋白可選擇性地與載體或佐劑配制在一起配伍形成疫苗。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述疫苗，其特征是所述載體或佐劑包括CPG、弗氏佐劑、脫乙酰殼多糖顆粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述疫苗，其特征是疫苗中純化的肺炎鏈球菌自溶酶蛋白主要溶于中性PBS或中性復(fù)方氯化鈉溶液，或其他溶液載體如水、葡萄糖、乙醇、鹽類(lèi)、緩沖液、甘油或者它們的組合。
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