[發明專利]肺炎鏈球菌自溶酶蛋白及其原核表達純化工藝和疫苗

無效

• 申請號: 200710027897.7
• 申請日: 2007-04-30
• 公開（公告）號: CN101063116A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 吳忠道;鮮墨;甘慧泉;袁竹青;余新炳
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36;C07K14/315;C07K7/08;C07K7/06;C12N15/31;C07K19/00;A61K39/09;A61P11/00
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 劉孟斌

1.一種肺炎鏈球菌自溶酶蛋白，它具有如下特征：①SDS-PAGE分析其分子量為34KDa左右；②來源于23F、19F、6A、6B或14血清型肺炎鏈球菌，是肺炎鏈球菌自身蛋白質的一種；③在原核表達中的表達形式可以是可溶性表達或包涵體表達。

2.一種制備肺炎鏈球菌自溶酶蛋白的原核表達純化工藝，它包括制備蛋白及其肽段或衍生物所需要的表達方式、發酵方式、制備流程、表達純化的優化條件，其中表達方式為可溶性表達；表達純化優化的條件包括以LB培養基為培養基，其PH值為6.4-PH?7.0；培養誘導溫度為25℃；誘導時間為1.5至2小時；表達過程中接種量為1％的接種量；裝液量為30％-40％。

3.根據權利要求2所述表達純化工藝，其特征在于發酵方式為搖瓶發酵表達。

4.根據權利要求2所述表達純化工藝，其特征在于在該蛋白的純化過程中，以中性PBS為蛋白質的溶劑，將緩沖液為中性PBS，PH值為7.0的親和層析柱作為純化工具，以保持所得到蛋白質的活性不變；純化流程中，結合蛋白質可溶性表達的特點，采用超聲與凍融的物理方式破碎工程菌。

5.一種來源于權利要求1所定義蛋白質的重組抗原表位肽段，其特征在于該重組抗原表位包括：

一個B細胞抗原表位，即氨基酸序列2～28(EINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHST)；

一個T細胞抗原表位，即氨基酸序列98～112(FMTDYRLYIELLRNL)；

一個柔性肽段，即(GLY-GLY-GLY-GLY-SER)₃，該柔性肽段位于兩個抗原表位之間。

6.一種如權利要求5所述重組抗原表位的分子克隆構建方法，包括：

以PCR擴增得到抗原表位的基因編碼序列，基因序列為

ATG?GAA?ATT?AAT?GTG?AGT?AAA?TTA?AGA?ACA?GAT?TTG?CCT?CAA?GTC?GGC?GTG?CAA?CCA?TAT?AGG

CAA?GTA?CAC?GCA?CAC?TCA?ACT?GGT?GGC?GGT?GGC?TCA?GGT?GGC?GGT?GGA?TCC?GGC?GGT?GGC?GGT

TCG?TTC?ATG?ACG?GAC?TAC?CGC?CTT?TAT?ATC?GAA?CTC?TTA?CGC?AAT?CTA?TAG

其中黑體為插入的柔性肽編碼基因序列，柔性肽前端為B細胞抗原表位編碼序列，后端為T細胞抗原表位編碼基因序列，ATG為加上的起始密碼子，TAG為加上的終止密碼子；

②三段肽段的連接采用酶切和DNA連接酶催化反應方法，并將從抗原表位的起始氨基酸開始第37，從柔性肽的起始氨基酸開始第9個氨基酸Gly的密碼子第三個堿基由C替換為A；將從抗原表位的起始氨基酸開始第38，從柔性肽的起始氨基酸開始第10個氨基酸Ser的密碼子第三個堿基由G替換為C；

③利用分子克隆技術構建的重組抗原表位為一個新的由三個肽段構成的人工重組小分子蛋白質，該小分子蛋白氨基酸序列為EINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHST-(GLY-GLY-GLY-GLY-SER)₃-FMTDYRLYIELLRNL。

7.一種以權利要求1所定義蛋白質制備的抗肺炎鏈球菌感染疫苗。

8.根據權利要求7所述疫苗，其特征是疫苗的主要成分肺炎鏈球菌自溶酶蛋白可選擇性地與載體或佐劑配制在一起配伍形成疫苗。

9.根據權利要求8所述疫苗，其特征是所述載體或佐劑包括CPG、弗氏佐劑、脫乙酰殼多糖顆粒。

10.根據權利要求7所述疫苗，其特征是疫苗中純化的肺炎鏈球菌自溶酶蛋白主要溶于中性PBS或中性復方氯化鈉溶液，或其他溶液載體如水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油或者它們的組合。