[發明專利]HLA－B27磁性酶聯免疫試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 200710027823.3
• 申請日: 2007-04-29
• 公開（公告）號: CN101294957A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發明（設計）人: 郭志程
• 申請（專利權）人: 郭志程
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司
• 代理人: 曾旻輝

1.一種HLA-B27磁性酶聯免疫試劑盒，主要包括酶稀釋液，酶結合物，其特征是，還包 括有：包被有與HLA-B27抗體共價耦聯免疫磁性微珠的微孔板板條，

所述微孔板板條的制備如下：共價耦聯免疫磁性微珠和HLA-B27抗體：PBS，pH6.5-7.5 洗滌1ml免疫磁性微珠1-5次，加入抗體8-12mg/ml，共1ml，混勻后，加入雙功能耦聯劑 BS³，使其終濃度為0.8-1.2mM，室溫孵育20-40min，加入終止液0.7-1.2M?Tris緩沖液，pH6.5 -7.5，室溫孵育7-13min，用PBS洗滌2-5次，恢復體積1ml；包被微孔板：將與步驟(A) 制備的HLA-B27抗體共價耦聯免疫磁性微珠2-4ul/孔加入到微孔板中；

所述酶稀釋液為1％BSA、0.1％Proclin300的0.01M?PBS；

所述酶結合物為與抗CD45抗體耦聯的HRP，HLA-B27抗體與酶結合物的稀釋度為1∶ 50。

2.根據權利要求1所述的HLA-B27磁性酶聯免疫試劑盒，其特征是，還包括有HRP耦 聯HLA-B27抗體分子的陽性對照。

3.根據權利要求1-2任一所述的HLA-B27磁性酶聯免疫試劑盒，其特征是，該試劑盒 用于檢測的全血標本是以EDTA-K3作為抗凝劑。

4.一種制備權利要求1所述HLA-B27磁性酶聯免疫試劑盒的方法，其特征是，主要包括 以下步驟：

(A)共價耦聯免疫磁性微珠和HLA-B27抗體：PBS，pH6.5-7.5洗滌1ml免疫磁性微珠1-5 次，加入抗體8-12mg/ml，共1ml，混勻后，加入雙功能耦聯劑BS³，使其終濃度為0.8-1.2mM， 室溫孵育20-40min，加入終止液0.7-1.2M?Tris緩沖液，pH6.5-7.5，室溫孵育7-13min，用 PBS洗滌2-5次，恢復體積1ml；

(B)酶結合物的制備；

(C)包被微孔板：

將與步驟(A)制備的HLA-B27抗體共價耦聯免疫磁性微珠2-4ul/孔加入到微孔板中。

5.根據權利要求4所述的上述HLA-B27磁性酶聯免疫試劑盒的制備方法，其特征是：所 述酶結合物的制備為：稱取10mgHRP置于干凈容器中，加入0.2mol/L?pH為5.6的醋酸鹽緩 沖液，待酶溶解后，加入0.06mol/LNaIO₄溶液，室溫反應10-30分鐘；加入0.16mol/L乙二 醇-10％氯化鈉溶液，于室溫下反應10-30分鐘后裝入透析袋中，用0.001mol/LpH為4.0的醋 酸鹽緩沖液透析過夜；加入2mol/L?pH為9.6的碳酸鹽緩沖液，加入待標記的抗CD45抗體 9-11mg后，4℃攪拌反應2小時，然后加入新配制的濃度為5mg/ml的NaBH₄溶液，4℃攪拌 反應1-3小時；滴加飽和的(NH4)₂SO₄溶液，4℃攪拌放置20-40分鐘，離心10-30分鐘， 棄上清，將沉淀溶于0.02mol/LpH為7.4的磷酸鹽緩沖液；用0.02mol/LpH為7.4的磷酸鹽緩 沖液透析18-30小時，取出透析液，加入等體積酶保護液后，再加入等體積甘油，混勻。

6.根據權利要求4所述的上述HLA-B27磁性酶聯免疫試劑盒的制備方法，其特征是：步 驟(C)加入到微孔板中的HLA-B27抗體共價耦聯免疫磁性微珠為3ul/孔。

7.根據權利要求4-6任一所述的上述HLA-B27磁性酶聯免疫試劑盒的制備方法，其特 征是：共價耦聯免疫磁性微珠和HLA-B27抗體為：PBS，pH7.0洗滌1ml免疫磁性微珠3次， 加入抗體10mg/ml，共1ml，混勻后，加入雙功能耦聯劑BS³，使其終濃度為1mM，室溫孵 育，30min，加入終止液1M?Tris緩沖液，pH7.0，室溫孵育10min，用PBS洗滌3次，恢復 體積1ml，然后加入1％BSA作為穩定劑，0.1％NaN₃作為防腐劑。