[發(fā)明專利]太平洋牡蠣EST微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710027648.8
• 申請日: 2007-04-23
• 公開（公告）號: CN101058831A
• 公開（公告）日: 2007-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 喻子牛;王艷紅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 賴漢光

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及海洋經(jīng)濟(jì)貝類太平洋牡蠣(Crassostrea?gigas)EST(Express?Sequence?Tag，表達(dá)序列標(biāo)簽)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選方法和應(yīng)用。

技術(shù)背景：

太平洋牡蠣原產(chǎn)于日本、韓國、中國等地，是世界上養(yǎng)殖范圍最廣、產(chǎn)量最高的海洋貝類，也是我國重要的海水養(yǎng)殖種類之一。在我國，太平洋牡蠣養(yǎng)殖業(yè)主要分布于遼寧，山東，福建，廣東等沿海地區(qū)。隨著對太平洋牡蠣遺傳多樣性研究、遺傳選育改良以及遺傳圖譜構(gòu)建等研究工作的不斷深入，對太平洋牡蠣分子標(biāo)記的需求也越來越多。遺傳改良或品種培育是太平洋牡蠣養(yǎng)殖穩(wěn)定發(fā)展的動力，許多研究表明，遺傳變異水平與生物的生長速度、抗病能力等生產(chǎn)性狀密切相關(guān)，因此，開發(fā)太平洋牡蠣的分子遺傳標(biāo)記，檢測太平洋牡蠣遺傳多樣性、研究其遺傳結(jié)構(gòu)，進(jìn)而實(shí)施分子標(biāo)記輔助選育，對于太平洋牡蠣的育種和養(yǎng)殖都具有十分重要的意義。

EST是指通過從cDNA文庫中隨機(jī)挑取的克隆，進(jìn)行大規(guī)模測序所獲得的cDNA的5’或3’端序列，長度一般為150-500bp。近年來大量快速增長的EST數(shù)據(jù)已成為SSR的重要來源，約有1-5％的EST含有SSR。與gSSR標(biāo)記相比，從EST中獲得SSR，建立EST-SSR標(biāo)記更經(jīng)濟(jì)、更有特點(diǎn)；由于EST是功能基因的表達(dá)片段，在其中發(fā)現(xiàn)的微衛(wèi)星標(biāo)記會直接和功能基因相關(guān)，并有可能和一些生產(chǎn)性狀相關(guān)聯(lián)，這些特點(diǎn)對遺傳圖譜構(gòu)建以及標(biāo)記輔助選育都有很高的應(yīng)用價值；同時，由于不同物種間基因共顯性和保守性，從一種物種中開發(fā)的EST-SSR可能同時用于近緣的其他物種研究，從而為比較基因組學(xué)、同源基因克隆提供新的途徑。因此，EST-SSR已被用于構(gòu)建遺傳圖譜、分離與鑒定新基因、基因表達(dá)差異研究、比較基因組研究和制備DNA芯片等方面。利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記，可能把太平洋牡蠣重要經(jīng)濟(jì)性狀與之關(guān)聯(lián)起來，達(dá)到分子標(biāo)記輔助育種的目的，并可進(jìn)一步進(jìn)行太平洋牡蠣功能基因的研究。目前還未見關(guān)于太平洋牡蠣EST微衛(wèi)星標(biāo)記的研究報道。

發(fā)明的內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種太平洋牡蠣EST微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選方法和應(yīng)用。

本發(fā)明目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：首先利用GeneBank公布的太平洋牡蠣的ESTs的序列，利用微衛(wèi)星檢索軟件SSRhunter進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)的查找，對于2-6個堿基重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)大于5的微衛(wèi)星片斷進(jìn)行篩選分離，從而得到含有微衛(wèi)星重復(fù)的ESTs序列；然后在微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼序列設(shè)計引物，并進(jìn)一步檢測優(yōu)化引物成為微衛(wèi)星標(biāo)記；最后對微衛(wèi)星標(biāo)記的重復(fù)性、穩(wěn)定性和多態(tài)性進(jìn)行綜合評價，得到微衛(wèi)星標(biāo)記。

從太平洋牡蠣ESTs序列進(jìn)行太平洋牡蠣微衛(wèi)星分析的步驟是從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫搜集并下載(以FASTA格式)已有的EST序列，利用SSRhunter軟件逐一查找分析所得的序列，對2—6個堿基重復(fù)單元、重復(fù)次數(shù)大于5的微衛(wèi)星DNA序列進(jìn)行分離；采用軟件DNAstar中的SeqMan對含有微衛(wèi)星的ESTs進(jìn)行聚類分析，選取聚類在不同contig中的ESTs設(shè)計引物。

對于太平洋牡蠣的ESTs設(shè)計引物，其設(shè)計引物參數(shù)為：(1)引物長度為17—25bp；(2)GC含量要求大于40％；(3)退火溫度大于40℃；(4)預(yù)期的PCR產(chǎn)物長度為100—300bp。

對于太平洋牡蠣利用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其加樣參數(shù)為：總體積20μl，其中含有正反向引物0.2μM、0.2mMdNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、1×PCR?buffer、1.5-2.5mM的Mg²⁺、Taq酶，模板量分別是50—100ng。

對于PCR產(chǎn)物的檢測：擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用8—10％的聚丙烯酰胺凝膠電泳—EB染色系統(tǒng)進(jìn)行檢測，電壓是1—8V/cm，電泳完畢之后用EB(溴化乙錠終，濃度0.5—0.6μg/ml)染色20—30分鐘，然后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察記錄成像結(jié)果，分析確定多態(tài)性。

在微衛(wèi)星重復(fù)的側(cè)翼序列利用引物設(shè)計軟件Primer?Premier?5.0和DNAstar中的Primerselect設(shè)計引物：Tm值在45—65℃之間；擴(kuò)增反應(yīng)分別用MJ-100和BioRad-200PCR儀，PCR程序?yàn)椋?4℃變性2分鐘之后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30或者40秒，根據(jù)不同的退火溫度退火30秒，72℃延伸30秒到1分鐘不等，反應(yīng)進(jìn)行30—35個循環(huán)。