[發明專利]一種納豆激酶的純化方法

無效

• 申請號: 200710027486.8
• 申請日: 2007-04-10
• 公開（公告）號: CN101058804A
• 公開（公告）日: 2007-10-24
• 發明（設計）人: 彭中健;夏楓耿;李運南;梁淑娃;董加喜;譚穎嫦;藍碧鋒;杜少平;明飛平
• 申請（專利權）人: 廣州市微生物研究所
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及納豆激酶，特別是涉及一種納豆激酶的純化方法。

背景技術

人體內的血栓常引發脈管栓塞、腦血栓中風、心肌梗塞、肺梗塞、極性肺原性心臟病等嚴重疾病。血栓栓塞病具有發病率高、致殘率高、死亡率高和復發率高等特點，極大地危害著人類的生命和健康，人們期望能研發和生產出更多高效優質的溶栓藥物在臨床應用。納豆激酶(Nattokinase，NK)自1987年發現至今，已經逐步得到廣泛深入的研究，其酰胺水解活性、纖溶活性以及溶血栓作用已經被證實。且納豆激酶與現用的鏈激酶、尿激酶、重組組織型纖溶酶原激活劑等溶栓藥物相比，具有安全性高、作用直接迅速、易被人體吸收、特異性高、在體內持續時間長、口服和注射均可等優點，可用于開發新一代的溶栓劑或保健食品，具有極為誘人的廣闊前景。

現有納豆激酶的純化方法大多存在工藝繁瑣，不易操作，純度低等問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有納豆激酶純化方法上存在的不足，提供一種工藝簡單，操作方便，可以規?；a，產品純度高的納豆激酶純化方法。

一種納豆激酶的純化方法，包括如下步驟：

(1)發酵液預處理：將納豆菌發酵液離心，收集上清液，上清液用0.2～0.45μm濾膜過濾，收集過濾清液；

(2)離子交換層析柱純化：離子交換層析所用凝膠為CM?SepharoseFast?Flow，凝膠先用pH6.8、含6～70mM的磷酸鹽緩沖液平衡好；調節過濾清液的離子濃度，使其電導率為1.6～2.2mS/cm，以6～15mL/min的流速將其加入柱中；先用pH6.8、6mM的磷酸鹽緩沖液洗滌柱床，再用pH6.8含6mM的磷酸二氫鈉和0～1M氯化鈉的洗脫液線型梯度洗脫，流速為5～10mL/min；(或把經調節離子濃度的過濾清液在加入柱之前先裝入塑料桶中，加入2L已平衡好的凝膠，調pH為6.0，用攪拌機慢速攪拌吸附30分鐘，吸附完成，濾掉清液，洗滌凝膠，凝膠上柱；再用pH6.8、6mM的磷酸鹽緩沖液平衡柱子，后用pH6.8，含6mM磷酸二氫鈉和100mM氯化鈉的溶液洗脫，流速為30～100mL/min)用紫外分光光度計在波長為280nm處檢測，收集OD₂₈₀為0.01以上的洗脫液；

(3)冷凍干燥：將納豆激酶洗脫液經濾膜過濾除菌，加入添加劑及賦型劑，分裝，冷凍干燥，獲得納豆激酶凍干粉劑。

在上述純化方法中，步驟(1)所述將納豆菌發酵液離心是采用高速冷凍離心機在4～10℃，8000～16000rpm的速度下離心5～10min；或者是采用發酵罐夾層冷卻法冷卻至4～15℃，用高速管式離心機以10000～16000rpm的速度離心。

在上述純化方法中，步驟(2)所述離子交換層析所用的柱規格為內徑3.5～5.5厘米，高20～30厘米；或為內徑16～20厘米，高38～60厘米。

在上述純化方法中，步驟(3)所述濾膜為0.2μm濾膜。

在上述純化方法中，步驟(3)所述的添加劑為吐溫-80，用量為0.05％，所述賦型劑為甘露醇，用量為2％。

在上述純化方法中，步驟(3)所述加入添加劑及賦型劑調節濃度為1000IU/mL后再分裝。

在上述純化方法中，步驟(3)所述冷凍干燥是指：在冷凍溫度為-40℃，真空干燥溫度為5～10℃條件下冷凍干燥30～36小時。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明的純化方法是將納豆菌發酵液離心，取上清液，過濾，濾液經離子交換層析柱，收集含納豆激酶的洗脫液，經冷凍干燥即獲得納豆激酶凍干粉劑。該純化方法工藝簡單，操作方便，可以規?；a，產品純度高，應用前景廣闊。

具體實施方式

實施例1

1.發酵液預處理

將納豆菌發酵液用高速冷凍離心機在4℃下，以8000rpm的速度離心10min，收集上清液。上清液用0.45μm濾膜過濾，收集過濾清液，作上柱液備用。

2.離子交換層析純化