[發明專利]轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法

無效

• 申請號: 200710027302.8
• 申請日: 2007-03-27
• 公開（公告）號: CN101113977A
• 公開（公告）日: 2008-01-30
• 發明（設計）人: 鄧海華;翁麗星;黎教良;徐金玲;李奇偉;汪聯輝;張瓊;陳仲華;沈萬寬;陳海寧;勞方業;楊湛端
• 申請（專利權）人: 廣州甘蔗糖業研究所;翁麗星;徐金玲;汪聯輝
• 主分類號: G01N33/00
• 分類號: G01N33/00
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司
• 代理人: 唐弟

技術領域

本發明涉及作物分子育種與抗性育種技術領域，尤其是轉Bt基因甘蔗抗蟲性鑒定方法。

技術背景

甘蔗螟蟲是我國蔗區廣泛發生且為害最為嚴重的一類甘蔗害蟲。因甘蔗螟蟲為害造成甘蔗損失一般達10％～25％，重者可達40％～60％，同時還導致甘蔗糖分損失和誘發某些莖部病害。

甘蔗螟蟲是鱗翅目的一類鉆蛀性害蟲。我國蔗區常見的甘蔗螟蟲有條螟、二點螟、黃螟、大螟和白螟等，其中，條螟(Proceras?venosatum?Walker)是為害最為嚴重的一種甘蔗螟蟲。甘蔗條螟在全國各蔗區都有發生。條螟為害在甘蔗苗期造成枯心，甘蔗拔節后造成螟害節、枯梢(死尾)、大量長側芽，遇大風時形成風折莖，導致甘蔗產量和糖分嚴重損失。

由于甘蔗本身缺乏抗源，甘蔗抗螟育種未取得大的進展，生產上沒有真正的抗螟品種。雖有螟害相對較輕的品種，但多是纖維份較高而不利于螟蟲取食的品種，其工藝性狀一般也較差。多數豐產高糖的甘蔗良種也是螟害較重的品種。長期以來，甘蔗螟蟲防治主要以農藥防治為主。長期大量使用殺蟲劑，既增加了生產成本，也造成環境污染，破壞生態平衡。值得注意的是，螟蟲的發生和為害并未因連年施用大量殺蟲劑而得到理想的控制。通過分子育種手段，導入外源抗蟲基因，選育抗蟲甘蔗品種并因地制宜地推廣應用，可望有效地控制甘蔗螟蟲的種群增長，大幅度減少農藥施用量和施用次數，減輕蟲害造成的損失。這無疑對增產增收、降低生產成本和減少環境污染都有著重大的意義。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt)能產生蛋白性質的伴孢晶體，對多種昆蟲、線蟲、螨類等原生動物具有特異的殺蟲活性對人畜無害，不污染環境，因而被廣泛應用于害蟲的生物防治。其中CryI系列的δ-內毒素對鱗翅目(Lepidoptera)害蟲特別有效，因而CryI中的許多基因已被廣泛用于植物的抗蟲基因工程。將Bt基因導入栽培甘蔗，將可解決甘蔗自身抗蟲基因源缺乏的問題，育成抗蟲品種。

Arencibia?A等人(Mol?Breeding?1997，3：247-255)將cryIAb基因構建于CaMV35S啟動子下游，轉化甘蔗，CryIAb蛋白在轉基因甘蔗中的表達量不高，無法高效地抵抗甘蔗鉆心蟲。這可能是由于適用于雙子葉植物的CaMV?35S啟動子在單子葉植物中表達不佳(Adang?MJ，Plant?Mol?Biol?1993，21：1131-1145)。Dawen等人(PlantScience?2003，165：743-750)報道，在轉基因甘蔗中PUbi啟動子(玉米泛激素啟動子)可帶動GUS基因表達，但測不到在CaMV?35S啟動子下GUS基因的表達。我們在甘蔗的轉基因瞬間表達試驗中也發現，PUbi啟動子比CaMV?35S啟動子強5～6倍(Weng，Li-Xing等，Pest?Management?Science，2005?In?Press)，獲得一批高表達的轉Bt基因抗蟲甘蔗品系。

抗蟲性評價是轉基因抗蟲育種的一道重要程序。轉Bt基因甘蔗抗蟲性可通過標記基因檢測、目的基因檢測、毒蛋白檢測和生物測定等方法來評價，但最終都要以自然條件下生長甘蔗的抗蟲表現為依據，即要經過田間條件或模擬田間條件的試驗來評價。田間抗蟲性鑒定的試驗周期長，受自然條件影響(如蟲源的自然分布、天敵干擾和風、雨影響等)大，很多不能人為控制的因素導致試驗處理間條件的不一致性和試驗結果的可比性，往往需要多年多試驗的結果去作綜合評價，因此難于在短時間內得到可靠的試驗結果。人工接蟲鑒定可有效地避免田間不可控因素的影響，并可在較短時間內獲得結果。但以往人工接蟲鑒定是以田間采集蟲卵，室內孵化出幼蟲為接種蟲源。螟蟲卵天敵自然寄生率高(達90％左右，甚至更高)，難于得到足夠的幼蟲供試驗之需，特別是待鑒定品系較多時。同時由于試驗蟲源來源不一致和接蟲時間難于統一而影響測定結果。

甘蔗條螟是發生最普遍、為害最嚴重的螟蟲，幼蟲在心葉取食，入侵后第2天就可見其取食留下的食痕(俗稱“花葉”)，食量大，中毒表現也快。本發明以甘蔗條螟為代表螟蟲種類，主要技術特征：(1)用于試驗的螟蟲種類具有較好的代表性，為害癥狀出現快、明顯可見，并有特異性，容易觀察和調查；(2)試驗蟲源來源和接蟲時間一致，接到每株待鑒定甘蔗上的幼蟲的來源和數量具可比性，并將同一來源的幼蟲在同一時間段平均分配到各株待測甘蔗植株上；(3)適宜的試驗甘蔗培育方法和抗螟性評價方法，在接蟲后7～10天可得到試驗結果。

發明內容