[發(fā)明專利]用單一特異性捕獲劑定量檢測(cè)分析物的新方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710025571.0
• 申請(qǐng)日: 2007-08-02
• 公開（公告）號(hào): CN101358969A
• 公開（公告）日: 2009-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫東旭;斯蒂芬·諾克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 孫東旭
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 徐州市三聯(lián)專利事務(wù)所
• 代理人: 周愛芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及采用一種特異性捕獲劑定量檢測(cè)一種分析物的新方法，適用于各種基于固相表面的檢測(cè)平臺(tái)，包括微孔板、濾膜、微磁球，等等。

背景技術(shù)

檢測(cè)生物(包括人類)組織樣本中特定蛋白質(zhì)因子的含量，對(duì)于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用具有非常重要的意義。例如，檢測(cè)病原微生物的特異性蛋白質(zhì)組分是目前診斷傳染病的主要手段；同樣，測(cè)定癌癥和心血管疾病的早期生物標(biāo)記蛋白質(zhì)因子含量的變化對(duì)于這些疾病的早發(fā)現(xiàn)早治療和療效觀察極為重要。隨著醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的不斷進(jìn)展，對(duì)各種蛋白質(zhì)因子進(jìn)行定量檢測(cè)的需求也越來越大。

為滿足這一不斷增長(zhǎng)的要求，近年來各種蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生，例如各種免疫檢測(cè)技術(shù)、雙向凝膠電泳、質(zhì)譜分析和肽圖譜分析等等。其中最方便、應(yīng)用范圍最廣也是目前使用最多的是免疫檢測(cè)技術(shù)中的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(Enzyme-Linked?ImmunoSorbent?Assay，簡(jiǎn)稱ELISA；參見Engvall和Perlman，1971，Immunochemistry?8：871-4.)。ELISA的具體操作方式有若干種，其中最常用的是夾心法酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(sandwich?ELISA)，用于定量檢測(cè)生物樣本中某種蛋白質(zhì)的濃度。夾心法ELISA采用能夠和同一種抗原蛋白質(zhì)的不同抗原決定簇結(jié)合的兩種不同但是互相配合的抗體來完成，一種抗體和抗原的結(jié)合不干擾另一種抗體和同一個(gè)抗原分子的結(jié)合。這種方法的技術(shù)要點(diǎn)是：(1)將捕獲抗體(capture?antibody)包被在某一固相表面上(最常用的是96-孔微量板的微孔底部平面)；(2)加入待測(cè)生物樣本，讓其中含有的抗原蛋白質(zhì)分子(分析物)與結(jié)合在固相表面上的捕獲抗體特異性結(jié)合，然后洗除未結(jié)合的非特異性物質(zhì)；(3)加入標(biāo)有某種報(bào)道分子(酶、生物素、半抗原、熒光基團(tuán)、寡聚核苷酸或其他類型分子)的檢測(cè)抗體(detection?antibody)，使之與固相表面上被捕獲的抗原分子特異性結(jié)合，然后洗除未結(jié)合的檢測(cè)抗體；(4)加入使報(bào)道分子產(chǎn)生信號(hào)的相關(guān)試劑(例如酶標(biāo)親和素、酶底物等)，然后用96-孔酶標(biāo)儀讀測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，或者直接測(cè)定報(bào)道分子(例如熒光強(qiáng)度等)的量，或用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增寡聚核苷酸后檢測(cè)。根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)度，參照分析物的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，從而確定樣本中分析物的濃度。雖然夾心法ELISA的特異性和靈敏度都比較高，但是該方法的應(yīng)用有一個(gè)重要局限性：如果要建立檢測(cè)一種分析物的夾心法ELISA檢測(cè)方法，必須擁有針對(duì)該分析物的兩種不同抗體(捕獲抗體和檢測(cè)抗體)，而且要求這兩種抗體對(duì)該分析物都擁有高度特異性和高度親合力，同時(shí)它們之間必須互相配合，即捕獲抗體和分析物的結(jié)合不影響檢測(cè)抗體對(duì)同一分析物分子的結(jié)合。這些要求在很大程度上限制了夾心法ELISA的更廣泛應(yīng)用，這是因?yàn)?，在?shí)際工作中往往要經(jīng)過很多努力、很長(zhǎng)時(shí)間才能獲得上述能夠互相配合的針對(duì)同一個(gè)分析物的兩種抗體。許多生物學(xué)上或臨床檢測(cè)上非常重要的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，盡管多年反復(fù)試驗(yàn)仍然無法獲得可以用于夾心法ELISA的配對(duì)抗體。而對(duì)于那些分子量較小或者抗原決定蔟較少并且靠在一起的蛋白質(zhì)，就更難獲得兩種互相配合的抗體。有時(shí)可以獲得一種擁有高特異性高親和力的抗體，但是要找到另一種具有相似優(yōu)點(diǎn)并且能夠互相配對(duì)的另一種抗體卻極為困難。這也是為什么目前市場(chǎng)上約有針對(duì)超過5000種不同蛋白質(zhì)的抗體，但只有約400-500種蛋白質(zhì)可以用夾心法ELISA進(jìn)行定量檢測(cè)。