[發明專利]一種準確簡便的蓑羽鶴性別鑒定方法

無效

• 申請號: 200710024387.4
• 申請日: 2007-06-18
• 公開（公告）號: CN101086013A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發明（設計）人: 陳國宏;張紅霞;包文斌;吳信生;徐琪;胡飛;孫志明;束婧婷;程金花;陳同海;王金美;劉鑫;吳云良;陳清;謝飛
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 揚州市錦江專利事務所
• 代理人: 江平

技術領域

本發明涉及一種準確簡便的蓑羽鶴性別鑒定的方法，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

性染色體連鎖的EE0.6(0.6kb-EcoRI-fragment)基因是從雞的W染色體克隆而來的，是一段單一序列，在目前已被檢測過的平胸和非平胸鳥類中都是保守的，可以選擇合適的引物對Z、W染色體上的同源拷貝進行特異性擴增來鑒定性別。由于雌性為ZW型，雄性為ZZ型，因此對PCR擴增產物電泳檢測時，可在雌性得到不同長度的片段，而雄性只能得到相同長度的片段。Itoh等(2001)通過利用EE1和EE4引物組合、EE2和EE3引物組合對EE0.6基因上的片段進行擴增來鑒定丹頂鶴、白枕鶴、蛇鷲、東方白鸛等數種鳥類的性別，并獲得了較好的結果；陳武等(2006)利用單對引物分別對W和Z染色體上的同源序列進行特異性擴增，也成功地對丹頂鶴、戴冕鶴、黑鸛等幾種鳥類的性別進行了鑒定。

目前，作為一種簡便的性別鑒定方法，應用EE0.6對鳥類，尤其是蓑羽鶴進行性別鑒定的研究很少，比較常用的是CHD基因，即染色體螺旋蛋白基因(Chromobox-heli-case-DNA?binding?gene)，EE0.6基因這兩對引物組合的應用也很少。

發明內容

本發明的目的是提供一種準確、操作簡便、可重復性強的蓑羽鶴性別鑒定的方法。

本發明的技術方案是：先通過兩對引物組合對蓑羽鶴基因組DNA的W、Z染色體上的特異序列進行擴增，再經1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用Gene?Genius凝膠成像儀進行拍照記錄，根據帶型判斷性別：雌性為兩條帶，雄性為一條帶；

所述兩對引物組合為：EE1(5’-ACAGTTTGTCTGTCTCCGGGGAA/AGCTGGAYTTCAGWSCATCTTCT-3’)、EE2(5’-TAGGCTGCAGAATACAGCAT/TTGTGCAGTTCTAGTCCATA-3’)和EE3(5’-CACCCTGGATTGGACAACCTATTTC/TCAGAGCACTCTTTCCAGGAA-3’)、EE4(5’-AAGCATAGAAACAATGTGGGAC/AACTCTGTCTGGAAGGACTT-3’)。

本發明利用對EE0.6基因在W、Z染色體上的特異序列的擴增所產生的不同帶型來判斷蓑羽鶴性別。本發明無需特殊的儀器要求，只需要掌握一般的PCR和瓊脂糖凝膠電泳的操作，就可進行簡便的鑒定，可重復性強，簡便易行。采用兩個引物組合EE1和EE2組合、EE3和EE4組合，對蓑羽鶴的性連鎖基因EE0.6在W和Z染色體上的特異片段進行擴增鑒定其性別，證明了EE0.6基因在鶴中是保守的，這兩對引物組合可以準確地鑒定蓑羽鶴的性別。利用分子方法對蓑羽鶴進行性別鑒定，能盡量減小對蓑羽鶴的傷害，盡早將繁殖期的蓑羽鶴進行配對，保證人工繁殖和人工育種的正確進行，方便不同動物園和保護區之間蓑羽鶴的交流。本發明所采用的引物組合同樣適合于其它非平胸鳥類的性別鑒定。

本發明在對蓑羽鶴基因組DNA的W、Z染色體上的特異序列進行擴增時，采用10μL體系：取0.5?U?Taq?DNA聚合酶、1.5mM?MgCl₂、200μM?dNTP、4pmol引物和100ng蓑羽鶴基因組DNA，加雙蒸水補至10μL。

蓑羽鶴基因組DNA的提取方法是有所改進的酚-氯仿萃取法：

取抗凝血30μL于1.5mL離心管中，加入300μL裂解液，裂解24小時后，加入6μL蛋白酶K和2μL?RNase，55℃水浴10～15小時后，分別加等體積的飽和酚、苯酚-氯仿-異戊醇混合液和氯仿-異戊醇混合液各抽提一次，留上清，加冰無水乙醇沉淀DNA，70％酒精洗滌，干燥，TE溶解，4℃保存備用。

附圖說明

圖1為EE1和EE2引物組合對蓑羽鶴的性別鑒定結果(一條帶為雄性，兩條帶為雌性)。

圖2為EE3和EE4引物組合對蓑羽鶴的性別鑒定結果(一條帶為雄性，兩條帶為雌性)。

具體實施方式

1、采用有所改進的酚-氯仿萃取法提取蓑羽鶴基因組DNA：

取抗凝血30μL于1.5mL離心管中，加入300μL裂解液(2M尿素，100mM?Tris-HCl，100mM?EDTA，1％SDS，pH8.0)裂解一天后，加入6μL蛋白酶K(PrK，濃度為5μg/μL)和2μLRNase(濃度為2.5μg/μL)，55℃水浴10～15小時。