[發明專利]根癌農桿菌介導zeocin抗性基因轉化工業化產甘油假絲酵母的方法

無效

• 申請號: 200710024145.5
• 申請日: 2007-07-23
• 公開（公告）號: CN101130781A
• 公開（公告）日: 2008-02-27
• 發明（設計）人: 饒志明;徐美娟;張君勝;沈微;方慧英;諸葛健
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/31;C12R1/72
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

根癌農桿菌介導zeocin抗性基因轉化工業化產甘油假絲酵母，將外源基因整合到宿主染色體上，屬于基因工程中轉化技術領域。

背景技術

轉化是酵母基因操作技術中的重要步驟之一。由于酵母細胞不像大腸桿菌和枯草芽胞桿菌等原核微生物那樣具有可以將外源DNA攝入細胞內的特殊生理狀態(感受態)，因此酵母轉化曾是酵母基因工程研究的一大限制因素。目前廣泛采用的酵母轉化方法主要有原生質體轉化法、醋酸鋰轉化法、電擊轉化法等。這些方法在釀酒酵母的遺傳轉化研究上已取得了巨大的成功。

由于工業應用酵母菌株和實驗室用的酵母菌株在細胞壁結構、生理生化特性、遺傳背景及生長環境等方面存在巨大的差異，在轉化工業應用酵母時需要建立相對應的轉化體系。但是，上面所述的轉化方法在轉化一些工業酵母菌株時往往存在轉化率低、轉化子穩定性差、難以重復等困難，有些菌株甚至無法轉化。針對這一問題，研究人員提出了不同的改進方法以及新的轉化方法。其中，根癌農桿菌(Agrobacterium?tumefaciens)介導的遺傳轉化法是有效的方法之一。

1995年Bundock等首次成功進行了根癌農桿菌介導酵母菌的遺傳轉化。進一步研究發現根癌農桿菌介導的遺傳轉化法具有轉化低拷貝、高頻率轉移、成本低、穩定性好、操作方便和重復性好、能轉化大片段DNA(大到50Kb的外源DNA)、能明顯提高轉化率獲得穩定的轉化子等優點，在應用領域中具有很大的潛能。

產甘油假絲酵母是目前我國用于工業化發酵生產甘油的優良菌株之一，它具有甘油產率高、耐高滲壓、發酵條件粗放、菌體生長速度及發酵速度快、轉化率高、發酵原料簡單等優點。除了甘油，產甘油假絲酵母還能產生多種其他多元醇，如赤蘚醇、D-阿拉伯醇和甘露醇等，因此是一株具有很高的潛在應用價值的酵母。采用基因工程手段構建重組菌是進一步改進產甘油假絲酵母性能的途徑，實現這一目標首先要獲得有效的載體和轉化方法，在此基礎上才有可能對產甘油假絲酵母代謝途徑進行有目的的改造，以達到提高甘油產量和改善工藝的目的。成功建立其遺傳轉化體系能改進甘油生產，還可以為通過代謝工程進一步構建高產其他多元醇的重組菌創造條件，所采用的轉化方法和載體構建方法也能為其他耐高滲酵母的基因工程改造提供借鑒。因此，建立產甘油假絲酵母的遺傳轉化體系具有重要意義。

本發明采用根癌農桿菌轉化系統來轉化產甘油假絲酵母，實現了產甘油假絲酵母的遺傳轉化體系的成功建立。

發明內容

本發明的目的是提供一種根癌農桿菌介導zeocin抗性基因轉化工業化產甘油假絲酵母的方法，構建雙元載體成功地實現了根癌農桿菌介導產甘油假絲酵母的轉化。并針對產甘油假絲酵母生長快的特點對轉化條件進行了適當的優化。為進一步研究產甘油假絲酵母打下了良好的基礎。

本發明的技術方案：根癌農桿菌介導zeocin抗性基因轉化工業化產甘油假絲酵母的方法，是以質粒pPICZB為模板通過PCR技術獲得zeocin抗性基因，再與線性化質粒pCAM?3300連接，獲得重組質粒pCAM?3300-zeocin；質粒pCAM?3300-zeocin轉化根癌農桿菌LBA4404，再和產甘油假絲酵母共培養，根癌農桿菌LBA4404/pCAM?3300-zeocin質粒轉化工業化產甘油假絲酵母；

(1)zeocin基因的克隆

根據zeocin基因的特異性設計引物：

引物R：5’-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3’；

引物F：5’-ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3’；

PCR擴增zeocin基因得到300bp的特異條帶；

PCR方法如下：取質粒pPICZB模板1μL，10×PCR緩沖液2μL，引物R、F各1μL，dNTPs2μL，Taq?DNA聚合酶0.5μL，總反應體積為20μL；循環參數：94℃預變性5min，94℃45s，56℃90s，72℃90s，35個循環，72℃延伸10min；

通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片斷膠回收試劑盒純化出0.3kb的目標片斷，純化好的目標片斷與pEGM-T-Easyvector連接保存；再用相應EcoRI酶切，膠回收zeocin目標基因，EcoRI酶切線性化質粒pCAM3300；在T4連接酶的作用下連接得到pCAM3300-zeocin；

(2)質粒pCAM3300-zeocin轉化根癌農桿菌LBA4404