[發(fā)明專利]根癌農(nóng)桿菌介導zeocin抗性基因轉化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710024145.5
• 申請日: 2007-07-23
• 公開（公告）號: CN101130781A
• 公開（公告）日: 2008-02-27
• 發(fā)明（設計）人: 饒志明;徐美娟;張君勝;沈微;方慧英;諸葛健
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N15/31;C12R1/72
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.根癌農(nóng)桿菌介導zeocin抗性基因轉化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母的方法，其特征是以質(zhì)粒pPICZB為模板通過PCR技術獲得zeocin抗性基因，再與線性化質(zhì)粒pCAM?3300連接，獲得重組質(zhì)粒pCAM?3300-zeocin；質(zhì)粒pCAM?3300-zeocin轉化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，再和產(chǎn)甘油假絲酵母共培養(yǎng)，根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM?3300-zeocin質(zhì)粒轉化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母；

(1)zeocin基因的克隆

根據(jù)zeocin基因的特異性設計引物：

引物R：5’-GTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAG-3’；

引物F：5’-ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTC-3’；

PCR擴增zeocin基因得到300?bp的特異條帶；

PCR方法如下：取質(zhì)粒pPICZB模板1μL，10×PCR緩沖液2μL，引物R、F各1μL，dNTPs?2μL，Taq?DNA聚合酶0.5μL，總反應體積為20μL；循環(huán)參數(shù)：94℃預變性5min，94℃45s，56℃?90s，72℃?90s，35個循環(huán)，72℃延伸10min；

通過瓊脂糖凝膠電泳分析反應產(chǎn)物，在加樣泳道出現(xiàn)目標條帶，用PCR片斷膠回收試劑盒純化出0.3kb的目標片斷，純化好的目標片斷與pEGM-T-Easyvector連接保存；再用相應EcoR?I酶切，膠回收zeocin目標基因，EcoR?I酶切線性化質(zhì)粒pCAM?3300；在T4連接酶的作用下連接得到pCAM?3300-zeocin；

(2)質(zhì)粒pCAM?3300-zeocin轉化根癌農(nóng)桿菌LBA4404

將重組質(zhì)粒pCAM?3300-zeocin通過電擊直接轉入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，在卡那霉素抗性平板上挑取抗性轉化子，提取質(zhì)粒酶切驗證，得到重組菌LBA4404/pCAM?3300-zeocin?；

(3)根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM?3300-zeocin質(zhì)粒轉化工業(yè)化產(chǎn)甘油假絲酵母：

將重組菌LBA4404/pCAM?3300-zeocin于LB培養(yǎng)基中，30℃，200?r/min搖床培養(yǎng)36?h，離心收集菌體；用等體積的IM培養(yǎng)基重懸，培養(yǎng)6h；接種產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5于YPD培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)過夜；產(chǎn)甘油假絲酵母的YPD培養(yǎng)液按1∶5稀釋到YPD新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6h；分別離心收集根癌農(nóng)桿菌菌體和產(chǎn)甘油假絲酵母，用生理鹽水清洗一次，用IM培養(yǎng)基重懸菌體，產(chǎn)甘油假絲酵母細胞終濃度達到10⁹個/mL，根癌農(nóng)桿菌細胞終濃度達到10¹¹個/mL，各取50μL加入20mL?IM培養(yǎng)基中30℃200r/min共培養(yǎng)過夜；取200μL培養(yǎng)液涂布鋪有玻璃紙的IM+AS固體培養(yǎng)基平板置于25℃培養(yǎng)24h；將玻璃紙轉接到SM培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天，篩選陽性酵母轉化子。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是重組根癌農(nóng)桿菌LBA4404/pCAM3300-zeocin介導轉化產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5的優(yōu)化轉化條件：

(1)IM固體培養(yǎng)基誘導時間優(yōu)化：優(yōu)化的共培養(yǎng)時間為24h；

(2)共培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌菌體濃度優(yōu)化：產(chǎn)甘油假絲酵母比根癌農(nóng)桿菌菌體細胞比例為1∶500-1000時，最高轉化率達到2個轉化子/10⁴個酵母細胞。