[發明專利]一種吸水鏈霉菌的谷氨酰胺轉胺酶酶原基因及其表達

無效

• 申請號: 200710023771.2
• 申請日: 2007-07-09
• 公開（公告）號: CN101126097A
• 公開（公告）日: 2008-02-20
• 發明（設計）人: 陳堅;吳敬;堵國成;任增亮
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/78;C12N1/20;C12R1/55
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種吸水鏈霉菌的谷氨酰胺轉胺酶酶原基因及其表達，屬于分子生物學領域。涉及一種編碼谷氨酰胺轉胺酶酶原的新DNA分子和其編碼的谷氨酰胺轉胺酶酶原。

背景技術

谷氨酰胺轉胺酶(蛋白質-谷氨酸-γ谷氨酰胺轉胺酶，Transglutaminase，簡稱MTG，EC?2.3.2.13)，又稱轉谷氨酰胺酶或谷氨酰胺酰-肽γ-谷氨酰胺酰基轉移酶，可以催化蛋白質分子內、分子間發生交聯，蛋白質和氨基酸之間的連接以及蛋白質分子內谷氨酰胺基的水解，從而進一步改善蛋白質功能性質，提高蛋白質的營養價值，生產出滿足人們需求的新型蛋白食品，被譽為“21世紀超級粘合劑”。

谷氨酰胺轉胺酶在食品加工中的應用主要包括：(1)通過催化蛋白質分子之間發生的交聯，改善蛋白質的溶解性、起泡性和乳化性等重要性能；(2)將某些人體必需氨基酸(如賴氨酸)共價交聯到蛋白質上，防止美拉德反應對氨基酸的破壞，提高蛋白質的營養價值；(3)用該酶交聯過的酪蛋白脫水后可形成耐熱、耐水性的薄膜，能夠用作食品包裝材料；(4)用于包埋脂類或脂溶性物質，催化蛋白質分子的去酰胺化。

谷氨酰胺轉胺酶在醫藥領域也有很好的應用前景。谷氨酰胺轉胺酶(即人體凝血因子XIII)在凝血過程中能夠加固纖維結構；在表皮角質化過程中形成角化層；加速傷口愈合；參與受體介導的蛋白質和多肽激素的胞吞作用等。這些生理功能也說明谷氨酰胺轉胺酶已成為醫藥工業研究者所矚目的焦點。最近在化妝品、紡織工業上也有學者開始關注谷氨酰胺轉胺酶，相關的應用研究正在展開。

目前報道的生產谷氨酰胺轉胺酶的方法主要有從動植物組織中提取，從微生物發酵法生產兩種。上世紀六十年代以來，對來自動物體(主要是豚鼠肝臟)的谷氨酰胺轉胺酶的純化方法、性質以及應用進行了廣泛研究。由于來源稀少、提取工藝復雜，因此這種酶的售價較高，很難應用于食品工業。因此期望能夠找到產谷氨酰胺轉胺酶(TG)的微生物菌株，1989年，Ando，Motoki等人(AndoH?et，al.Agric?Biol?Chem，1989，53：2613-2617)首先報道用微生物發酵法生產MTG。國內對發酵法生產谷氨酰胺轉胺酶的研究起步較晚。江南大學環境技術研究室是國內較早開展微生物法發酵生產谷氨酰胺轉胺酶的科研單位。研究小組鄭美英等人以茂原鏈輪絲菌(Streptoverticillium?mobaraense)為出發菌株，通過發酵優化最高達到3.37U/ml；柏映國等人用傳統方法篩到一株高產谷氨酰胺轉胺酶的菌株鑒定為吸水鏈霉菌(Streptomyces?hygroscopicu；CCTCC?M203062；中國專利：03152956.9，2003)，通過150L中試，MTG酶活最高達到4.20U/mL。

近年來，隨著基因工程技術的發展，人們開始嘗試采用重組DNA技術構建工程菌來進一步提高MTG的發酵水平。Washizu等人和Takehana等人首先進行了MTG的克隆與表達，但是酶活水平都很低，無法達到工業化生產的要求。Date等人將編碼谷氨酰胺轉胺酶的基因轉入Corynebacterium?glutamicum中表達，并同時將一段可以特異切割谷氨酰胺轉胺酶前提酶原的蛋白酶(SAM-45)基因轉入宿主表達，結果獲得了很高的產量，最高酶活達到16U/mL。國外在基因工程方面的研究主要包括采用不同的表達載體，融合不同來源的酶原區域，共表達切割酶原的蛋白酶基因，利用不同的宿主等，在產酶機理和分子水平上有深入研究，國內在2004年周建等利用大腸桿菌宿主將枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉氨酶基因與硫氧還蛋白融合表達，但是必須經過復雜的復性操作后才得到較低的生物活性；江南大學唐名山等利用茂原鏈霉菌的MTG基因在大腸桿菌E.coliM15中嘗試表達，產物主要為包涵體，通過Ni-NTA親和柱分離純化和稀釋法復性。徐斌等同樣利用茂原鏈霉菌的TG基因在大腸桿菌中表達，表達產物也是包涵體。Christian?K等(Christian?K.et，al.Enzyme?and?Microbial?Technology2007，40：1543-1550)利用茂原鏈霉菌的谷氨酰胺轉胺酶基因在大腸桿菌中獲得部分可溶性表達，但酶活不高。利用基因工程菌獲得可溶性表達有活性的谷氨酰胺轉胺酶還需要進一步研究。