[發明專利]一種吸水鏈霉菌的谷氨酰胺轉胺酶酶原基因及其表達

無效

• 申請號: 200710023771.2
• 申請日: 2007-07-09
• 公開（公告）號: CN101126097A
• 公開（公告）日: 2008-02-20
• 發明（設計）人: 陳堅;吳敬;堵國成;任增亮
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/78;C12N1/20;C12R1/55
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種來源于吸水鏈霉菌(Streptomyces?hygroscopicus)CCTCC?M203062的谷氨酰胺轉胺酶酶原，其基因核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1。

2.如權利要求1所述的谷氨酰胺轉胺酶酶原，其氨基酸組成為SEQ?IDNO：2。

3.如權利要求1所述的谷氨酰胺轉胺酶酶原的表達，其特征是：

(1)吸水鏈霉菌的谷氨酰胺轉胺酶基因的獲得

通過NCBI基因庫查到平板鏈霉菌(Streptomyces?platensis)，茂原鏈霉菌(Streptomyces?mobaraensis)，肉桂鏈霉菌(Streptomyces?cinnamoneus)，弗氏鏈霉菌(Streptomyces?fradiae)的谷氨酰胺轉胺酶完整氨基酸序列，根據文獻報道結果找到酶原起始序列和終止序列，然后通過比對相應堿基序列；另一方面在純化獲得來源于天然吸水鏈霉菌的酶原之后，通過N端氨基酸測序；確定PCR的引物如下：

P1：5’-GCTAGCGGTGACGACGAGG-3’

P2：5’-TTACGGCCAGCCCTGCTTTAC-3’

利用上述引物，以提取的吸水鏈霉菌CCTCC?M203062總DNA為模板，PCR反應在50μL體系中進行，反應條件為在95℃變性5min后開始循環，然后95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35個循環后，再于72℃延伸10min；通過PCR擴增得到1170bp的DNA片段，編碼389個氨基酸；測序結果在NCBI利用Blast分析，結果顯示該基因序列與其它鏈霉菌產谷氨酰胺轉胺酶的基因序列同源性最高達92％，Blast?RID：7A2RYJJS015；

(2)谷氨酰胺轉胺酶酶原基因的克隆

將擴增得到的DNA利用上海生工UNIQ-10柱式膠回收試劑盒回收純化，將純化產物4.5μL，pMD-18T載體0.5μL，按照試劑盒操作，16℃連接12小時，連接產物熱擊轉化大腸桿菌JM109，操作如下：

1)將JM109感受態細胞從-80℃冰箱取出迅速放在冰上，溶化5min；

2)10μL連接產物加入至100μL?JM109感受態細胞中，冰中放置30分鐘；

3)42℃加熱90秒鐘后，再在冰中放置3分鐘；

4)加入950μL37℃預熱的SOC培養基，37℃振蕩培養90分鐘；

5)在含有0.04mg/mL?5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷、0.024mg/mL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、0.1mg/mL氨芐青霉素的L-瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落；

6)16h后，挑選白色菌落，??挑出的菌落接種于含有0.1mg/mL氨芐青霉素的LB培養基，37℃培養過夜，利用上海生工UNIQ-10柱式質粒抽提試劑盒操作得到含有目的基因的質粒pMD/pro-MTG；

(3)吸水鏈霉菌谷氨酰胺轉胺酶的表達

利用限制性內切酶NcoI和BamHI從pMD/pro-MTG雙酶切切下，將表達載體pET20b也同樣雙酶切，然后利用T4DNA連接酶進行連接反應，將連接產物先轉化大腸桿菌JM109，得到正確的表達質粒pET/pro-MTG后再將表達質粒轉化BL21(DE3)或Rosetta(DE3)pLysS，得到含有表達質粒pET/pro-MTG的工程菌命名為BL21/pET-MTG或Rosetta/pET-MTG；

誘導表達按下面操作進行：

1)將甘油管保存的BL21/pET-MTG或Rosetta/pET-MTG菌液0.1ml快速加入到裝有25ml含有0.1mg/mLAmp的LB培養基的50ml三角瓶中，200rpm種子培養過夜；

2)按3％的接種量將種子分別接種到三個裝有50ml含有0.1mg/mL?Amp的LB培養基的250ml三角瓶中，37℃，200rpm培養4h；

3)加入終濃度為0.4mM?IPTG，降低溫度至24℃誘導4h；

4)取3mL步驟3)處理后的發酵液12000rpm離心2min，發酵液上清幾乎沒有酶活；離心沉淀用pH8.0的1.0mL?Tris-HCl緩沖液懸浮，懸浮液經過超聲破壁，12000rpm離心5min，離心上清有可溶性的酶原存在，經過胰蛋白酶100U/ml37℃處理10分鐘后，最高酶活達到0.14U/mL；

5)對發酵上清液、破壁沉淀、破壁上清液，分別進行蛋白電泳SDS-PAGE表達產物的分布：胞外幾乎沒有可溶性谷氨酰胺轉胺酶酶原，胞內有少量可溶性谷氨酰胺轉胺酶酶原，大部分為不可溶的包涵體。