[發明專利]一種谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法

有效

• 申請號: 200710023721.4
• 申請日: 2007-07-06
• 公開（公告）號: CN101121747A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發明（設計）人: 陳堅;吳敬;堵國成;張東旭
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/36;C07K1/16
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法，屬于生物制品的分離純化技術領域。本發明涉及一種以陽離子交換色譜和疏水色譜為主要技術手段的谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法。

背景技術

谷氨酰胺轉胺酶(Transglutaminase，簡稱TGase)是一種催化?；D移反應的轉移酶，能催化蛋白質分子內、分子間發生交聯、蛋白質和氨基酸之間的連接以及蛋白質分子內谷氨酰胺基的水解反應，從而直接改變蛋白質本身以及蛋白質所附著的細胞、組織等的結構與功能性質的特性，提高蛋白質的營養價值，生產出滿足人們需求的新型蛋白食品?，F在已經廣泛應用在許多方面：在食品加工過程中，可以保護食品蛋白質中的賴氨酸避免發生化學反應，從而保護限制性氨基酸，提高食品的營養價值；在肉制品加工中，谷氨酸胺轉胺酶的交聯作用將一些低價值的碎肉進行重組，從而改善其外觀、結構、風味，以提高其營養價值和市場價值；在水產品保鮮中，可通過形成可食性的薄膜，包埋脂類物質；在乳制品加工中，提高蛋白質的營養性；在醫藥工業中，谷氨酸胺轉胺酶包埋脂類或脂溶性物質，形成耐熱耐水性的膜；在非肉類的豆類食品中，提高食品的彈性和持水能力；在紡織行業，還被用來提高蠶絲織物以及羊毛織物的品質。

Tgase發酵過程中以酶原(Pro-TGase)的形式分泌，Pro-TGase須經過谷氨酰胺轉氨酶激活蛋白酶(TGase-activating?protease)的切割活化，獲得成熟的具有活性的TGase.而這一激活過程受一種分子量12kDa的蛋白質抑制，即谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子。這一抑制因子對TGase活化過程起調控作用，但具體的調控機制目前還不清楚。對谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子調控機制的研究將極大的促進發酵生產TGase水平。谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化是對其調控機制研究的基礎，因此，采用簡單有效的方法對谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子進行分離純化成為研究的熱點。

發明內容

本發明的目的是提供一種谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法，采用陽離子交換色譜和疏水色譜為主要技術手段，有效簡便的分離純化吸水鏈霉菌所產谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子，使之達到電泳純，為進行進一步的調控機制研究奠定基礎。

本發明的技術方案：一種谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的分離純化方法，工藝步驟為：

(1)乙醇沉淀

將吸水鏈霉菌(Streptomyces?hygroscopicus)WSH03-13的發酵液離心去除菌體后，加入乙醇至終濃度為70％，緩慢攪拌使之完全溶解，并于4℃靜置10-20min，10000rpm冷凍離心15-30min，收集蛋白沉淀，將沉淀復溶于適量pH?5.0的HAc-NaAc緩沖液中，制成上樣液。

發酵所用菌種吸水鏈霉菌(Streptomyces?hygroscopicus)WSH03-13已在中國專利ZL03152956.9公開，授權公告號CN?1208452?C，授權公告日2005年6月29日。

(2)陽離子交換色譜

采用Fractogel?EMD?SO₃^-陽離子交換柱以pH?5.0的HAc-NaAc緩沖液平衡，將1個柱體積的上樣液以0.5-1mL/min的速度加入陽離子交換色譜中，用pH?5.0的含0-1M?NaCl梯度的HAc-NaAc緩沖液以同樣的速度洗脫至280nm紫外吸收峰為0，谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子的活性部分在梯度洗脫時的第一個出峰，收集活性峰；

(3)疏水色譜

陽離子交換柱上獲得的活性部分用pH?7.0的Tris-HCl緩沖液平衡過夜，Phenyl?Sepharose?6Fast?Flow疏水柱以10個柱體積含有10％NaCl的pH?7.0的Tris-HCl緩沖液平衡，將1個柱體積的上樣液以0.5-1mL/min的速度加入疏水色譜中，用pH?7.0的Tris-HCl緩沖液以同樣的速度洗脫至280nm紫外吸收峰為0，再以1個柱體積的去離子水洗脫，收集活性峰，即為所需要的電泳純谷氨酰胺轉胺酶激活蛋白酶抑制因子溶液。

本發明的有益效果：

(1)分離工藝簡單，周期短。本分離純化工藝由酒精沉淀、陽離子交換色譜和疏水色譜三部分組成，硫酸銨沉淀約為1h，陽離子交換色譜約為3h，疏水色譜約為3h。