[發明專利]D－乳酸診斷/測定試劑盒及D－乳酸濃度測定方法

無效

• 申請號: 200710023230.X
• 申請日: 2007-06-13
• 公開（公告）號: CN101324561A
• 公開（公告）日: 2008-12-17
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50;G01N21/31;C12Q1/26;C12Q1/00
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技術領域

本發明涉及一種具有D-乳酸特異性的D-乳酸診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定D-乳酸濃度的方法，屬于醫學/食品檢驗測定技術領域。

背景技術

L-乳酸是近年來人們十分關注并發展較快的有機酸。同時L-乳酸具有在食品、飼料、醫藥、塑料、飼料、農藥、日用化工、造紙及電子工業等多領域應用前景。

L-乳酸是大多數生物體代謝作用的終產物。僅少數微生物(例乳酸菌屬、明串珠菌屬)能形成D-乳酸。生產酸奶時非常注意檢測乳酸鹽，以評估微生物是否產生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，則可能是微生物造成了污染。

乳酸鹽濃度的異常升高與多種疾病如糖尿病、酸毒癥等疾病有密切的關系。L(+)-Lactate是人體中乳酸鹽代謝的主要中間產物，并且存在于血液中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的1-5％。

血乳酸測試作為一個監護、監測運動員訓練能力的手段，把血乳酸值作為衡量運動員有氧耐力水平、無氧訓練能力、身體疲勞恢復等方面的一個重要數據，供安排訓練時參考。

酶法分析是國際上公認的分析方法，已被多個國際權威組織或機構采納：如IFU(國際果汁生產者協會)，AIJN(歐盟果蔬汁及飲料生產者聯盟)，及MEBAK，OICC，VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標準檢測方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用具有D-乳酸特異性的酶循環擴增法(Enzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?ColorimetricMethod)及酶聯法(Couple?Reaction)技術，計量通過酶聯反應生成吲嗒胺色原(Indamine?dye)或醌亞胺色原(Quioneimine?dye)所導致在400-700nm波長處吸光度的上升，得以測定D-乳酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的D-乳酸診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行D-乳酸濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明D-乳酸濃度測定方法原理如下：

D-乳酸+2高鐵細胞色素c?D-乳酸脫氫酶丙酮酸+2亞鐵細胞色素c

丙酮酸+氨離子+還原型輔酶?丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+水+輔酶

丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+過氧化氫

過氧化氫+還原型色原體組合?過氧化物酶?吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水

這種方法應用具有?D-乳酸特異性的?D-乳酸脫氫酶(D-Lactatedehydrogenase；EC?1.1.2.4；EC?1.1.2.5)酶聯丙氨酸脫氫酶(alaninedehydrogenase；EC?1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine?oxidase；EC?1.4.3.19)及過氧化物酶(peroxidase；EC?1.11.1.7)酶促反應終點/速率比色法。D-乳酸脫氫酶作為作用酶，功能為將D-乳酸酶解產生丙酮酸。丙氨酸脫氫酶也作為作用酶，它的酶促作用使丙酮酸產生丙氨酸；甘氨酸氧化酶作為循環酶可以一再將丙氨酸再次變回丙酮酸，使丙酮酸不斷地被重復循環利用；同時不斷地重復循環產生過氧化氫。過氧化物酶(peroxidase；EC?1.11.1.7)作為顯色酶，通過和過氧化氫的作用，使無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm(根據還原型色原體組合的不同而定)波長處測定染料-吲嗒胺色原(Indamine?dye)或醌亞胺色原(Quioneimine?dye)-含量高低的光吸收大小程度/速度，得出氨基酸(氮)濃度大小測定結果。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，如下成分關系的本發明D-乳酸診斷/測定試劑盒較為理想：

緩沖液????????????100mmol/L

穩定劑????????????500mmol/L

還原型輔酶????????0.25mmol/L

2高鐵細胞色素c????10mmol/L

氨離子????????????20mmol/L

D-乳酸脫氫酶??????10000U/L