[發明專利]一種硝西泮人工抗原的制備方法

無效

• 申請號: 200710022543.3
• 申請日: 2007-05-11
• 公開（公告）號: CN101071133A
• 公開（公告）日: 2007-11-14
• 發明（設計）人: 胥傳來;李秋生;彭池方;周亞南;陶冠軍;秦昉;徐一平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N33/53;G01N33/558;G01N21/79
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種硝西泮人工抗原的制備方法，屬于生物化工技術領域。

背景技術

硝西泮(Nitrazepam)為苯二氮卓類鎮靜安眠藥，化學名稱為：1，3-二氫-7-硝基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮卓-2-酮。曾用作動物飼料添加劑，作為生長促進劑，具有使動物嗜睡少動，生長快且有改變肉質的作用。也用在屠宰和動物檢疫之前，或將動物轉移屠宰之前，起鎮靜作用，以減輕動物緊張狀態，降低動物傷害和死亡率。此類藥物常見嗜睡，可見無力、頭痛、暈眩、惡心、便秘，偶見皮疹、肝損害、骨髓抑制等不良反應。若隨意在飼料中添加此類藥物，蓄積的藥物通過食物鏈進入人體，將造成巨大的危害。為此許多國家將此類藥物列入禁用藥物名單。目前，國內外有關硝西泮的檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、薄層色譜法(TLC)、氣-質聯用法(GC-MS)、液-質聯用法(LC-MS)等，但這些方法不僅需要昂貴的儀器設備，對檢材的要求也比較高，需要進一步的提純處理才能進行，這已經不能達到現代檢測對快速、方便、準確的要求。近年來，國外已經開展了對苯二氮卓類免疫分析方法的研究，但國內目前在這方面還是一片空白。為了加強對國內肉制品的監督力度和保障人民的身體健康，有必要展開對苯二氮卓類免疫分析方法的研究，有必要提供一種有效的硝西泮人工抗原的制備方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種硝西泮人工抗原的制備方法，所制備的產品可用于苯二氮卓類免疫分析方法的研究，為今后人們的研究提供了方便的途徑。

本發明的技術方案：第一步為半抗原的制備及檢測，以硝西泮為原料，利用鐵粉還原法使硝西泮苯環上的硝基還原為胺基；第二步為人工抗原的制備及檢測，利用重氮化法對半抗原上的胺基進行重氮化并使之與牛血清蛋白(BSA)結合，制備硝西泮的人工抗原。其反應方程式為：

硝西泮　1，3-二氫-7-胺基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮卓-2-酮　硝西泮-牛血清蛋白

工藝步驟為：

(1)人工半抗原的制備：

稱取9mmol還原鐵粉于50ml圓底燒瓶中，加入10ml水、3mmol氯化銨，水浴中加熱15min。另稱取硝西泮3mmol，用一定量的甲醇溶解后，分3次加入上述的反應液當中，回流反應4-6h。趁熱過濾鐵粉，將濾液進行減壓蒸餾，得到的殘留用少量熱甲醇溶液溶解，低溫析出沉淀，過濾，干燥得到2mmol半抗原1，3-二氫-7-胺基-5-苯基-2H-1，4-苯并二氮卓-2-酮備用。

反應終點監測：硅膠薄層板的制作：稱取硅膠12g，溶解在40ml0.5％質量濃度的羥甲基纖維素鈉溶液中，用玻璃棒充分攪拌成糊狀，超聲波振蕩1分鐘，均勻涂布在玻璃板上，置于陰涼處自然干燥后，放入105℃的烘箱中活化1h，然后放入干燥箱中備用。

薄層層析法檢測：硅膠薄板下端1cm處作一水平線，吸取反應液1μl點于線上，點樣結束后吹干，將薄板放入層析缸中，層析液為乙酸乙酯-正己烷混合溶劑，乙酸乙酯:正己烷體積比為1:1，展開至薄板3/4處，取板，吹干溶劑。將薄板置于紫外分析儀中，在254nm波長觀察，在Rf為0.25處觀察到顯色點作為反應終點。

(2)人工抗原的制備：

制備A液：稱取0.1mmol半抗原于20ml燒杯中，加入10ml二甲基甲酰胺、1ml水和1ml的1N鹽酸，形成深紅色溶液，冷卻至2℃。然后逐步滴加1M亞硝酸鈉溶液，用淀粉碘化鉀試紙監測，直到試紙變藍停止滴加，低溫下攪拌1h，此液為A液。

硼酸鹽緩沖液：0.2mol/L硼酸：硼酸12.37g加水至1000ml，0.05mol/L硼砂：硼砂19.07g加水至1000ml，將上述兩溶液以體積比2:8的比例混合即為pH9.0的硼酸鹽緩沖液。

制備B液：稱取400mg的牛血清蛋白溶于15ml的pH9.0硼酸鹽緩沖液，低溫保存，此液為B液。

在低溫攪拌下，將A液逐滴地滴加到B液中，并用1N的氫氧化鈉溶液調節pH，使pH始終保持在9。在4℃條件下攪拌保存過夜，即得到人工抗原混合液。

透析袋前處理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用。

將人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.05M的碳酸氫鈉溶液和2×2L的去離子水透析4-6天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，即得到人工抗原：硝西泮-牛血清蛋白。

(3)硝西泮人工抗原的鑒定