[發明專利]抗幽門螺桿菌感染的尿素酶表位融合肽脂質體疫苗

無效

• 申請號: 200710022485.4
• 申請日: 2007-05-22
• 公開（公告）號: CN101062015A
• 公開（公告）日: 2007-10-31
• 發明（設計）人: 吳梧桐;趙文鋒;徐旭東
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: A61K9/127
• 分類號: A61K9/127;A61K39/116;A61K39/106;A61P31/04;A61P1/04;C12N15/62
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技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及霍亂毒素B亞單(CTB)位與幽門螺桿菌(Helicobacter?pylori)尿素酶B亞單位(UreB)表位融合肽(CtUBE)表達質粒的構建、轉化、表達、純化及CtUBE脂質體疫苗的制備，提供了一種抗幽門螺桿菌感染的預防與治療性疫苗。

背景技術

幽門螺桿菌是引起胃炎、消化道潰瘍及胃癌等疾病的主要病因，所有臨床分離的幽門螺桿菌菌株均表達尿素酶，而且同時高度保守。尿素酶可以分解尿素產生氨氣，中和胃酸，為幽門螺桿菌的定植提供有利環境。由于尿素酶的這些特點，使其成為抗幽門螺桿菌疫苗研制中候選抗原的熱點。但有研究表明，用完整的尿素酶免疫動物并不能很好的抑制尿素酶的活性，因而不能完全阻止幽門螺桿菌在胃內的定植(Infect?Immun?1992，60：4826-31)。進一步研究表明，完整的尿素酶可以刺激機體產生兩種單克隆抗體，其中一種為可以促進尿素酶活性的構象表位特異性抗體，另一種為B亞單位上的線性表位特異性抗體，線性表位特異性抗體可以抑制構象表位特異性抗體對尿素酶活性的促進作用(Infect?Immun?2001，69：6597-603；Biomedical?Research?2005，26：35-42)。已經有大量實驗表明，尿素酶B亞單位(UreB)不僅對幽門螺桿菌感染具有預防作用，而且還可以在一定程度上清除體內已經感染的幽門螺桿菌。這些結果提示，如果用尿素酶B亞單位的表位刺激機體免疫系統，可以避免產生構象表位特異性抗體，從而增強以尿素酶為免疫原所刺激的免疫反應對幽門螺桿菌感染的抑制和清除效果。

霍亂毒素(CT)是霍亂弧菌分泌的一種不耐熱腸毒素，由1個28kDa的A亞基(CTA)和5個完全相同的11.6kDa的B亞基(CTB)組成，形成AB結構。其中CTA具有ADP-核糖基轉移酶活性，為CT的毒性亞基；CTB可與大多數哺乳動物細胞表面的神經節苷脂GM1特異性結合，為CT的無毒性亞基，每個CTB與GM1都有很高的親和力，5個CTB彼此以非共價鍵結合形成五聚體，充當CTA與受體細胞之間的橋梁。CTB與GM1結合后，將CTA轉移到受體細胞膜上或胞漿內，從而激活G蛋白，活化的G蛋白又激活腺苷酸環化酶，導致細胞內cAMP濃度升高，最終引起腹瀉。由于CTB為CT的無毒性亞單位及其特異性結合GM1活性，因而被用作黏膜免疫佐劑受到了廣泛的研究。大量的動物實驗結果表明，CTB是一種很好的黏膜免疫佐劑和弱免疫原的載體，同時還可以賦予半抗原免疫原性，增強弱免疫原的免疫原性。

脂質體為一種生物膜雙分子層囊性微球，由水相中脂質雙層疏水區的脂肪鏈通過疏水鍵相互聚集自行收縮排列而形成，在其形成過程中可包裹水溶性成分獲得顆粒形態，被包裹的內容物可以受到脂質體膜的保護。水溶性抗原包被于脂質體中可借助脂質體的傳遞被直接送達抗原提呈細胞的胞質中，脂質體膜基質及附加的修飾成分還可以直接活化免疫細胞的信號傳遞系統。在脂質體膜的保護下，抗原分子可以不受體液成分的破壞，脂質體類疫苗可用于多種黏膜途徑的免疫接種。通過選擇脂質體膜基質組分及對脂質體膜加以修飾，還可以選擇所誘導的免疫反應的類型。淋巴結樹突狀細胞和組織巨噬細胞都能夠吞噬脂質體，在這些細胞內抗原經過加工表達于I型主要組織相容性分子(MHC?I)，激發免疫反應，誘導特異性T細胞和細胞毒性T細胞免疫。因而，脂質體被廣泛用作疫苗的傳遞載體和免疫佐劑。

在幽門螺桿菌感染的預防與治療研究中，發展了各種動物模型，利用這些動物模型，可以揭示幽門螺桿菌在許多相關性疾病發生、發展和轉歸中的作用，以及對幽門螺桿菌疫苗的預防和保護效果的評價。小鼠體型小、易繁殖、來源便利、屬系多樣是作為動物模型的好材料。通過大量的實驗研究，已經成功地在小鼠體內建立了胃炎和十二指腸炎模型，此模型炎癥部位同人類相似，被廣泛應用于抗幽門螺桿菌疫苗的研究。

發明內容

本發明的首要目的是提供一種抗幽門螺桿菌感染的尿素酶表位融合肽脂質體疫苗。

本發明的另一個目的是提供該脂質體疫苗的制備方法。

本發明的第三個目的是提供幽門螺桿尿素酶B亞單位與黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位融合肽的制備方法(包括融合肽的基因克隆與工程菌的構造、表達及表達產物的純化)。

本發明的最后一個目的是公開該質體疫苗的用途。