[發明專利]由玉米漿發酵－酶催化法合成7－氨基－3－脫乙酰氧基頭孢烷酸

有效

• 申請號: 200710021342.1
• 申請日: 2007-04-09
• 公開（公告）號: CN101285089A
• 公開（公告）日: 2008-10-15
• 發明（設計）人: 胡曉;王玉成;李桂根;王靜康;王理想;王友志;趙紅;周偉軍;王圣良;李維泉;王健;周平江;路一飛
• 申請（專利權）人: 徐州瑞賽科技實業有限公司
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12R1/465
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物酶工程技術領域，涉及制備和提純7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)的生物合成方法。

背景技術

頭孢菌素類抗生素是β-內酰胺抗生素的重要一種。起初，是由產黃支頂孢(Acremonium?chrysogenum)天然產生。近年來，主要通過人工合成法來獲取。7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)是合成頭孢菌素類抗生素的關鍵母核，通過人工合成方法來制取7-ADCA，再進一步合成頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢克羅、頭孢他美酯和頭孢羥氨芐等多種頭孢素類抗生素。7-ADCA的合成方法主要有化學合成法、半合成法和生物合成法。

目前，化學合成和半合成法仍是合成7-ADCA主要方法：EP0169144(1986)介紹，以青霉素G鉀為原料，經過氧化、酰化、擴環、水解和裂解等反應過程而制得7-ADCA。CN1201795A介紹，以青霉素鉀鹽為原料，經氧化、硅酯化、環裂、分子重排、環合、水解和再裂解等反應合成7-ADCA。由于化學合成法的步驟復雜、反應條件要求高，特別是裂解等過程采用了較高的溫度，使得產品質量差和成本高，也帶來環保的問題，因此，人們又采用了化學與生物合成相結合的半合成法。將化學合成的裂解等反應過程改為酶催化法，這樣可以使化學合成中的一些不利反應得到一定程度的改進。如張玉祥等，“7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸的合成研究”(中國抗生素雜志，2000，25卷，178-180)；曲紅梅等，“從青霉素G生產7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸”(中國醫藥工業雜志，2000，8卷)。

生物合成法是近年發展起來的制備7-ADCA的方法，又有兩重方法。其一，是以青霉素G鉀為原料，使用擴環酶和酰化酶催化法制取7-ADCA，如，CN1807581A介紹，產黃青霉菌及其在生產7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的應用。另一種是發酵法，以青霉素為原料，經過發酵法實現擴環，經酰基轉移酶裂解等過程制備7-ADCA。如，CN1840687A介紹，將青霉素、水、發酵酶、營養液等，放在一起發酵，用有機溶劑萃取，再經裂解、脫色和結晶等過程制取7-ADCA。CN1840687A介紹，7-氨基-3-去乙酰氧基頭孢烷酸的發酵直通生產方法，是以青霉素為原料，與水、發酵消泡劑、發酵酶、營養液一起發酵，再經萃取、裂解、脫色和結晶等過程而制取7-ADCA。各種方法幾乎都是用青霉素G鉀為原料，采用各種方法合成7-ADCA。

如今，化學法合成7-ADCA，已經逐步被淘汰。半合成法、生物合成法已經被普遍采用，特別是發酵法是被普遍看好的新方法。國內也已經引進了半合成法和生物合成法，還都是以青霉素G鉀為原料，生產成本比較高，同時，關鍵的固定化酶等還主要依賴進口，而發酵法的工藝技術還沒有達到工業化的水平。

在現代化生物工程領域中，膜分離技術的應用越來越受到關注，因為膜分離設備，可以很好地將大分子和小分子物質分離開，而且作為催化劑的大分子物質(酶分子)和細胞的活性損失較小，可以進行反復使用。膜分離技術還可以應用到酶催化反應后的廢水處理，可以用很低的成本，達到很好的處理效果。膜分離技術操作簡單，成本低，容易實現連續化操作。這為發酵法制備7-ADCA提供了強有力的援助，說明該技術的工業化應用時機已經成熟。

發明內容

本發明的目的在于提供一種發酵-酶催化法合成7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的方法：以玉米漿為原料，用帶棒鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)的擴環酶基因，對玉米漿進行菌株轉化，使其在培養基中發酵，并在培養基中加入苯乙酸，玉米漿經擴環和與苯乙酸作用后，生成苯乙酰基-7-ADCA。用乙酸丁酯萃取發酵液，得到苯乙酰基-7-ADCA的萃取溶液。用水反萃取上述溶液，又得到苯乙酰基-7-ADCA的水溶液。在該水溶液中加入酰基轉移酶和營養液構成酶反應培養基，在適宜的工藝條件下，苯乙酰基-7-ADCA經脫苯乙酰基側鏈，而得到7-ADCA。

采用發酵-酶催化的生物合成法，包括種子培養基的培養、發酵培養基的培養、酶反應培養基的培養、有機溶劑萃取、水反萃取、酶催化脫酰基、萃取結晶和重結晶等過程。其中，種子培養基的培養過程，就是擴環菌的轉錄和發酵過程。

本發明通過下述方法實現的：

1、種子培養基的培養：將帶棒鏈霉菌(Streptomyces?clavuligerus)的擴環酶基因，接種于種子培養基中，經調培養基的pH值，消毒后，放于旋轉搖床，控制一定的溫度、轉速和培養時間，即可收獲種子培養基。