[發(fā)明專利]從動物血中分離三種酶(制劑)的聯(lián)產(chǎn)工藝

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710021100.2
• 申請日: 2007-03-28
• 公開（公告）號: CN101275129A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁勤生;周永祥
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州市勁奧醫(yī)療器械有限公司
• 主分類號: C12N9/74
• 分類號: C12N9/74;C12N9/08;C12N9/10
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1.?一種從動物血中分離三種酶的聯(lián)產(chǎn)工藝，其工藝步驟為：

A.新鮮動物血加檸檬酸三鈉抗凝劑，充分?jǐn)嚢瑁ㄟ^離心機(jī)離心(3000rpm，30min)得血漿和血球。血漿提取凝血酶，血球提取SOD和CAT；

B.凝血酶提取

a.血漿加水稀釋，用1％乙酸調(diào)節(jié)pH5.3，離心5-10min，離心棄去離心液，收集沉淀，的凝血酶原；

b.分離、沉淀、洗滌：取凝血酶原溶于NaCl溶液中(0.9％)加入CaCl₂(1.5％)，攪拌10min，冷室放量1n，離心分離，沉淀為血纖維蛋白，溶液加等量丙酮，靜置過應(yīng)，沉淀用乙醚洗滌，真空干燥的粗制凝血酶；

c.除雜質(zhì)、沉淀、干燥，去粗酶溶于0.9％CaCl₂溶液中，0℃放置6h過濾，然后用1％乙酸條pH至5.5，離心棄沉淀。清夜加工倍量冷丙酮，沉淀分別用乙醇、乙醚洗滌，真空干燥即得精致凝血酶；

C.SOD和CAT混合液制備

將血球加等體積0.9％NaCl溶液洗二次，獲得了干凈的紅細(xì)胞，然后加等體積的去離子水溶血30min，溶血液加二價金屬氯化物用于去除雜蛋白。65℃加熱10min，離心的含SOD和CAT的粗酶液。然后用截留分子量10萬的過濾膜將二酶分開，過濾流擊液含分子量較小的SOD等蛋白，濃縮液含分子量較大的CAT等蛋白。過濾液備用分別用作提取SOD和CAT等酶的原料；

D.SOD提取

上述過濾清液加入0.3mol/L的CuCl₂和ZnCl₂溶液，充分混勻，然后用截留分子量10000的過濾膜濃縮至原體積的1/10~1/2的過濾濃縮液。熱度性(65℃，10min)去雜蛋白，離心的清液，接著DEAE-SephadexA-50柱，即可得比活在5000u/(mg。蛋白)的高純度SOD。SOD在液體中易失活，通常將其制成凍干粉；

E.CAT的提取

上述濃縮液，加等量0.3mol/L的溶液，充分?jǐn)嚢瑁缓笥媒亓?0萬分子量的過濾膜濃縮至原體積的1/2，重復(fù)二次。然后條pH至4.5，先進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，然后加蛋白沉淀劑聚丙烯酸鈉(PA)，離心棄沉淀(3000rpm，30min)，這樣就可以得到CAT的精制溶液。在常溫下，CAT易失活，通常在精制液中加0.5％Na₂S₂O₃和3％的甘油保護(hù)劑，這樣CAT的保存活力至少在半年以上。