[發明專利]從動物血中分離三種酶(制劑)的聯產工藝

無效

• 申請號: 200710021100.2
• 申請日: 2007-03-28
• 公開（公告）號: CN101275129A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 袁勤生;周永祥
• 申請（專利權）人: 蘇州市勁奧醫療器械有限公司
• 主分類號: C12N9/74
• 分類號: C12N9/74;C12N9/08;C12N9/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分離酶的生產工藝，尤其是涉及一種從動物血中分離三種酶的聯產工藝，屬于生物化學制備領域。

背景技術

SOD、CAT、THR都是酶，它們主要功能有：SOD是一種藥用酶，它是一種活性氧自由基的轉移清除劑，在臨床上主要用于腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、放射治療后遺癥及有關炎癥的防止上，此外在食品、日化等領域也已廣泛得到應用；THR是機體凝血系統中的天然成分，在臨床上已開發成為一種新型局部止血藥。而CAT在現代紡織業、乳業、造紙業及食品醫藥行業上已有應用，用于清除過量的(殘余的)過氧化氫。

目前許多專利文獻對上述三酶的制備方法均有大量的報道，但大都是單產。聯產工藝報道較少，主要有：王永權等，生物工程學報[2005，21(3)：466~472]報道從紅細胞中采用推層析法分離SOD、CAT和血紅蛋白新工藝(二酶聯產)；辛春艷等，[河北省科學院學報，2002，19(4)：250~253]從豬血中獲得凝血酶、SOD和水鮮蛋白(二酶聯產)；凌敏等，[廣西醫科大學學報，2005，22(3)：363~364]研究了從豬血中分離SOD、血紅素和蛋白胨工藝；美國專利，[1982，US?patent，4341867。Jack?T.Johansen，Rungsted?K’yst，Denmark，Process?for?recouering?eng’ymes?from?Blood]報道從血液中同時提取SOD、CAT及碳酸酐酶的工藝(三酶聯產)。

發明內容

本發明的目的是，根據上述的技術缺陷，提出了一種簡化工藝、避免用有機溶劑等化學方法、提高工藝效率和產品質量的從動物血中分離三種酶的聯產工藝。

本發明的技術方案是這樣實現的：一種從動物血中分離三種酶的聯產工藝，其工藝步驟為：

1、新鮮動物血加檸檬酸三鈉抗凝劑，充分攪拌，通過離心機離心(3000rpm，30min)得血漿和血球。血漿提取凝血酶，血球提取SOD和CAT。

2、凝血酶提取

1)血漿加水稀釋，用1％乙酸調節pH5.3，離心5-10min，離心棄去離心液，收集沉淀，的凝血酶原。

2)分離、沉淀、洗滌：取凝血酶原溶于NaCl溶液中(0.9％)加入CaCl₂(1.5％)，攪拌10min，冷室放量1n，離心分離，沉淀為血纖維蛋白，溶液加等量丙酮，靜置過應，沉淀用乙醚洗滌，真空干燥的粗制凝血酶。

3)除雜質、沉淀、干燥，去粗酶溶于0.9％CaCl₂溶液中，0℃放置6h過濾，然后用1％乙酸條pH至5.5，離心棄沉淀。清夜加工倍量冷丙酮，沉淀分別用乙醇、乙醚洗滌，真空干燥即得精致凝血酶。

3、SOD和CAT混合液制備

將血球加等體積0.9％NaCl溶液洗二次，獲得了干凈的紅細胞，然后加等體積的去離子水溶血30min，溶血液加二價金屬氯化物用于去除雜蛋白。65℃加熱10min，離心的含SOD和CAT的粗酶液。然后用截留分子量10萬的過濾膜將二酶分開，過濾流擊液含分子量較小的SOD等蛋白，濃縮液含分子量較大的CAT等蛋白。過濾液備用分別用作提取SOD和CAT等酶的原料。

4、SOD提取

上述過濾清液加入0.3mol/L的CuCl₂和ZnCl₂溶液，充分混勻，然后用截留分子量10000的過濾膜濃縮至原體積的1/10~1/2的過濾濃縮液。熱度性(65℃，10min)去雜蛋白，離心的清液，接著DEAE-SephadexA-50柱，即可得比活在5000u/(mg。蛋白)的高純度SOD。SOD在液體中易失活，通常將其制成凍干粉。

5、CAT的提取

上述濃縮液，加等量0.3mol/L的溶液，充分攪拌，然后用截留10萬分子量的過濾膜濃縮至原體積的1/2，重復二次。然后條pH至4.5，先進行等電點沉淀，然后加蛋白沉淀劑聚丙烯酸鈉(PA)，離心棄沉淀(3000rpm，30min)，這樣就可以得到CAT的精制溶液。在常溫下，CAT易失活，通常在精制液中加0.5％Na₂S₂O₃和3％的甘油保護劑，這樣CAT的保存活力至少在半年以上。

具體實施方式

一種從動物血中分離三種酶的聯產工藝，其工藝步驟為：

1、將20克檸檬酸三鈉加入到1000克的牛血中，3000rpm離心30min，得到600克血漿和400克血球。