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[發明專利]基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法無效

專利信息
申請號: 200710020681.8 申請日: 2007-03-22
公開(公告)號: CN101187666A 公開(公告)日: 2008-05-28
發明(設計)人: 龔愛華;張志堅;孫湘蘭;步雪峰;肖德生;楊勇;王穆兵;谷曉楚 申請(專利權)人: 江蘇大學
主分類號: G01N33/68 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N21/31
代理公司: 南京知識律師事務所 代理人: 汪旭東
地址: 212013江蘇省*** 國省代碼: 江蘇;32
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摘要:
搜索關鍵詞: 基于 elisa 免疫 共沉淀 試驗 方法
【權利要求書】:

1.基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法,其特征在于:

按照下述步驟進行:

(1)細胞內總蛋白的提取:用磷酸緩沖液洗滌細胞,然后,在細胞中加入細胞裂解液,將細胞離心,取上清液備用;

(2)用蛋白質A的抗體包被96孔塑料板:選擇與蛋白質A相應的抗體,抗體從商業公司訂購,用碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液稀釋抗體,稀釋濃度為1~10μg/ml,再將稀釋液加入到96孔塑料板中進行包被,每孔加100~200μl,37℃2~6小時或4℃過夜;

(3)封閉:用1~2wt%牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉余下的空白位點,37℃中孵育4~6小時;

(4)加樣:將步驟1中的上清液稀釋,總蛋白濃度為1~10μg/ml,再將稀釋液加入到步驟2中已包被的塑料板的反應孔中,每孔加100~200μl,在37℃中孵育1~2小時,同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔;

(5)加入與蛋白質B的一抗:選擇與蛋白質B相應的抗體,抗體從商業公司訂購,磷酸鹽緩沖液稀釋抗體,濃度為10~20μg/ml,于各反應孔中,加入稀釋的蛋白質B的抗體100~150μl,37℃孵育0.5~1小時,洗滌;

(6)于各反應孔中,加入與蛋白質B的抗體相應的辣根過氧化物酶標記二抗,37℃孵育0.5~1小時,洗滌;

(7)加底物液顯色:于各反應孔中加入顯色底物溶液100~150μl,37℃放置10~30分鐘;

(8)終止反應:于各反應孔中加入0.1-0.2mmol硫酸;

(9)結果判定:在酶標儀檢測儀上,檢測吸光度。

2.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法,其特征在于:步驟2中包被條件為每孔100μl,4℃過夜;抗體的稀釋濃度為1.25μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml。

3.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法,其特征在于:步驟3中牛血清白蛋白(BSA)溶液為2wt%,孵育時間為6小時。

4.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法,其特征在于:步驟4中稀釋的上清液中總蛋白濃度為1μg/ml,加入到96孔塑料板的體積為每孔100μl;孵育時間為2小時。

5.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法,其特征在于:步驟5中抗體的稀釋濃度為10μg/ml,加入到96孔塑料板的體積為每孔100μl,孵育1小時。

6.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法,其特征在于:步驟6中孵育時間為1小時。

7.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法,其特征在于:步驟7中底物液顯色溶液為四甲基聯苯胺(TMB),加入到96孔塑料板的體積為每孔100μl,反應時間為20分鐘。

8.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法,其特征在于:步驟8中2M硫酸加入到96孔塑料板的體積為每孔50μl~100μl。

9.根據權利要求8所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法,其特征在于:步驟8中硫酸加入到96孔塑料板的量為每孔50μl。

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