[發明專利]基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法

無效

• 申請號: 200710020681.8
• 申請日: 2007-03-22
• 公開（公告）號: CN101187666A
• 公開（公告）日: 2008-05-28
• 發明（設計）人: 龔愛華;張志堅;孫湘蘭;步雪峰;肖德生;楊勇;王穆兵;谷曉楚
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N21/31
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 汪旭東

1.基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法，其特征在于：

按照下述步驟進行：

(1)細胞內總蛋白的提取：用磷酸緩沖液洗滌細胞，然后，在細胞中加入細胞裂解液，將細胞離心，取上清液備用；

(2)用蛋白質A的抗體包被96孔塑料板：選擇與蛋白質A相應的抗體，抗體從商業公司訂購，用碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液稀釋抗體，稀釋濃度為1～10μg/ml，再將稀釋液加入到96孔塑料板中進行包被，每孔加100～200μl，37℃2～6小時或4℃過夜；

(3)封閉：用1～2wt％牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉余下的空白位點，37℃中孵育4～6小時；

(4)加樣：將步驟1中的上清液稀釋，總蛋白濃度為1～10μg/ml，再將稀釋液加入到步驟2中已包被的塑料板的反應孔中，每孔加100～200μl，在37℃中孵育1～2小時，同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔；

(5)加入與蛋白質B的一抗：選擇與蛋白質B相應的抗體，抗體從商業公司訂購，磷酸鹽緩沖液稀釋抗體，濃度為10～20μg/ml，于各反應孔中，加入稀釋的蛋白質B的抗體100～150μl，37℃孵育0.5～1小時，洗滌；

(6)于各反應孔中，加入與蛋白質B的抗體相應的辣根過氧化物酶標記二抗，37℃孵育0.5～1小時，洗滌；

(7)加底物液顯色：于各反應孔中加入顯色底物溶液100～150μl，37℃放置10～30分鐘；

(8)終止反應：于各反應孔中加入0.1-0.2mmol硫酸；

(9)結果判定：在酶標儀檢測儀上，檢測吸光度。

2.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法，其特征在于：步驟2中包被條件為每孔100μl，4℃過夜；抗體的稀釋濃度為1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml。

3.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法，其特征在于：步驟3中牛血清白蛋白(BSA)溶液為2wt％，孵育時間為6小時。

4.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法，其特征在于：步驟4中稀釋的上清液中總蛋白濃度為1μg/ml，加入到96孔塑料板的體積為每孔100μl；孵育時間為2小時。

5.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法，其特征在于：步驟5中抗體的稀釋濃度為10μg/ml，加入到96孔塑料板的體積為每孔100μl，孵育1小時。

6.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法，其特征在于：步驟6中孵育時間為1小時。

7.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法，其特征在于：步驟7中底物液顯色溶液為四甲基聯苯胺(TMB)，加入到96孔塑料板的體積為每孔100μl，反應時間為20分鐘。

8.根據權利要求1所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法，其特征在于：步驟8中2M硫酸加入到96孔塑料板的體積為每孔50μl～100μl。

9.根據權利要求8所述的基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法，其特征在于：步驟8中硫酸加入到96孔塑料板的量為每孔50μl。