[發(fā)明專利]基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710020681.8
• 申請日: 2007-03-22
• 公開（公告）號: CN101187666A
• 公開（公告）日: 2008-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 龔愛華;張志堅;孫湘蘭;步雪峰;肖德生;楊勇;王穆兵;谷曉楚
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N21/31
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所
• 代理人: 汪旭東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特指一種基于ELISA法的免疫共沉淀試驗方法，具體地講指一種快速、高通量、定量檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的免疫共沉淀-酶聯(lián)試驗技術(shù)，建立板式固相免疫共沉淀-酶聯(lián)試驗的定量檢測方法，用于快速篩查和定量檢測共沉淀蛋白質(zhì)。

背景技術(shù)

目前，研究蛋白質(zhì)間的相互作用有多種方法，常用的有酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫沉淀、Pull-down等方法。其中，免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是相對穩(wěn)定、簡便的方法，也是在蛋白質(zhì)組的科學(xué)研究中的得到了廣泛應(yīng)用的一種方法，它是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)來研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，能夠確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。但這種方法還有三個明顯缺陷：一是兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是方法本身具有冒險性，必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果；三是操作過程復(fù)雜，浪費較多的蛋白質(zhì)樣品，只能檢測到納克級(ng)，所以靈敏度較低。另外，與上述其他幾種研究細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)間相互作用的方法一樣具有醫(yī)學(xué)一些不足之處，如操作程序復(fù)雜，技術(shù)操作要求高，所用耗材昂貴，費事、費時、重現(xiàn)性差等。這已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究進程的瓶頸，茲需一種能夠快速、定量、高通量篩查蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的檢測方法。

盡管也有學(xué)者對上述一些方法作了一些改進，或者發(fā)明了一些新的檢測方法，依然存在耗材昂貴，費事、費時、重現(xiàn)性差的不足之處，如意大利學(xué)者Persani等在《自然-臨床實踐內(nèi)分泌代謝雜志》上發(fā)表的題為“技術(shù)的洞察：現(xiàn)代檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的方法顯示有功能的促甲狀腺素受體的聚合結(jié)構(gòu)”(Persani?L，Calebiro?D，Bonomi?M.Technology?Insight：modern?methods?to?monitor?protein-protein?interactions?reveal?functional?TSH?receptoroligomerization，Nat?Clin?Pract?Endocrinol?Metab.2007，3(2)：180-90.)文章中，總結(jié)了國外學(xué)者發(fā)明的一些用于在活細胞內(nèi)觀察兩種蛋白質(zhì)的相互作用情況的現(xiàn)代檢測方法，這些技術(shù)是基于福斯特共振熒光能量轉(zhuǎn)移的物理學(xué)檢測方法。這些方法的優(yōu)勢是能夠?qū)崟r觀察活細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)間的相互作用，但技術(shù)要求高，且設(shè)備昂貴。

目前，最簡單的研究兩蛋白質(zhì)相互作用的是酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)，在體外驗證兩種蛋白質(zhì)的相互作用，具有高通量、速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、定量等優(yōu)點。然而，該方法目前僅用于定量檢測某一種蛋白質(zhì)的含量，其優(yōu)勢未能充分發(fā)揮出來。本發(fā)明就是利用了ELISA的原理及其上述優(yōu)勢來彌補免疫共沉淀的不足之處，發(fā)展了一個定量、快速、高通量檢測蛋白質(zhì)間的相互作用的方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明提出一種新的技術(shù)方案，將免疫共沉淀法和酶聯(lián)免疫吸附檢測法結(jié)合起來，即，利用酶聯(lián)免疫吸附檢測法中的96孔塑料板來捕獲目的蛋白(蛋白質(zhì)A)-興趣蛋白(蛋白質(zhì)B)-抗興趣蛋白抗體復(fù)合物，然后用抗興趣蛋白抗體相對應(yīng)的辣根過氧化物酶標記二抗，顯色，酶標儀檢測。本發(fā)明簡化了實驗過程，提高了檢測系統(tǒng)的敏感度，具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性的特點，降低了實驗成本，提高了實驗效率。

本發(fā)明可通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的：

(1)細胞內(nèi)總蛋白的提?。河昧姿峋彌_液(PBS)洗滌細胞，然后，在細胞中加入細胞裂解液，將細胞離心，取上清液備用；

(2)用蛋白質(zhì)A的抗體包被96孔塑料板：選擇與蛋白質(zhì)A相應(yīng)的抗體，抗體從商業(yè)公司訂購，用碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液稀釋抗體，稀釋濃度為1～10μg/ml，再將稀釋液加入到96孔塑料板中進行包被，每孔加100～200μl，37℃2～6小時或4℃過夜；

(3)封閉：用1～2wt％牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉余下的空白位點，37℃中孵育4～6小時；

(4)加樣：將步驟1中的上清液用磷酸鹽緩沖液稀釋，總蛋白濃度為1～10μg/ml，再將稀釋液加入到步驟2中已包被的塑料板的反應(yīng)孔中，每孔加100～200μl，在37℃中孵育1～2小時，同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔；

(5)加入與蛋白質(zhì)B的一抗：選擇與蛋白質(zhì)B相應(yīng)的抗體，抗體從商業(yè)公司訂購，磷酸鹽緩沖液稀釋抗體，濃度為10～20μg/ml，于各反應(yīng)孔中，加入稀釋的蛋白質(zhì)B的抗體100～150μl，37℃孵育0.5～1小時，洗滌；