[發(fā)明專利]一種大白菜特異蛋白質(zhì)/同工酶的分離純化方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710018761.X
• 申請(qǐng)日: 2007-09-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101168559A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張魯剛;張少麗;惠麥俠;張明科
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K1/14
• 分類號(hào): C07K1/14;C07K4/10
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 李鄭建

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物蛋白質(zhì)組學(xué)和發(fā)育生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從白菜花蕾中提取分離特異蛋白質(zhì)/同工酶的方法。

背景技術(shù)

生物功能的主要執(zhí)行者是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組能夠反映出生物系統(tǒng)所處的狀態(tài)，如細(xì)胞周期的特定時(shí)期、分化的不同階段，不同的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)狀況，溫度、應(yīng)激和病理狀態(tài)等都有其特異蛋白質(zhì)組，因此蛋白質(zhì)組學(xué)的研究可望提供精確、詳細(xì)的有關(guān)細(xì)胞或組織狀況的分子描述。科學(xué)界預(yù)言：21世紀(jì)生命科學(xué)的熱點(diǎn)將從基因組學(xué)轉(zhuǎn)入蛋白質(zhì)組學(xué)，后者將成為新的研究前沿。

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中亟待解決的問(wèn)題是：如何才能分離純化出自己感興趣的特異酶或蛋白。

分離純化某一特定蛋白質(zhì)或酶沒(méi)有特定的方法，一般程序可以分為前處理、粗分級(jí)、細(xì)分級(jí)三步。前處理指把蛋白質(zhì)從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。一般粗分級(jí)這一步的分離多用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法。細(xì)分級(jí)一般使用較多的是層析法，層析法包括凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。層析法的操作過(guò)程多是在室溫下進(jìn)行，不穩(wěn)定的蛋白尤其是酶很容易被降解，對(duì)純化很是不利。另外值得注意的是一般的酶蛋白量都比較低，用層析法進(jìn)行分離有時(shí)會(huì)遇到不出現(xiàn)峰的現(xiàn)象，所以目的酶常被當(dāng)成廢液而被丟棄，沒(méi)辦法回收，因此聚集和純化低含量具有生命活性功能的蛋白質(zhì)，尤其是同工酶，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的瓶頸。

雙向電泳由于其具有高分辨能力使之成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)分離最有力的技術(shù)平臺(tái)。其實(shí)驗(yàn)過(guò)程一般包括樣品制備、等電聚焦(IsoelectricFocusing?IEF)、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、染色和圖像分析等步驟。第一向等電聚焦電泳目前多采用進(jìn)口的商品干膠條進(jìn)行，需要專門的設(shè)備，價(jià)格昂貴；操作時(shí)間長(zhǎng)，一般都需要20小時(shí)以上；聚焦完畢不進(jìn)行染色，直接進(jìn)入下步的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，整個(gè)過(guò)程相當(dāng)于黑箱操作，聚焦好壞不能及時(shí)獲知，必需待到第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳染色完畢才可知。第二向的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳每板凝膠只能上一根膠條即一個(gè)樣品，要想分析比對(duì)多個(gè)樣品需進(jìn)行多板凝膠的配制及電泳，無(wú)形間增加了比對(duì)結(jié)果的誤差。第一向等電聚焦電泳凝膠上不僅包括了目的酶或蛋白，還包含有其它雜質(zhì)蛋白，這些雜質(zhì)蛋白會(huì)隨同目的蛋白一起轉(zhuǎn)到第二向進(jìn)行再分離，結(jié)果使得第二向出現(xiàn)眾多的蛋白點(diǎn)，為尋找目的蛋白增添了一定的難度，這些問(wèn)題的存在成為蛋白質(zhì)快速分離純化研究的難點(diǎn)。

總之，蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展需求快速、準(zhǔn)確、低成本的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于通過(guò)解決聚集和純化低含量具有生命活性功能的蛋白質(zhì)的問(wèn)題、在等電聚焦電泳同時(shí)分析多個(gè)樣品、SDS聚丙烯酰胺凝膠同時(shí)上多個(gè)目的條帶、全程檢測(cè)、提高目的性等問(wèn)題，提供一種從白菜花蕾中提取分離特異蛋白質(zhì)/同工酶的方法，該方法為進(jìn)一步蛋白質(zhì)測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

一種從白菜花蕾中提取分離特異蛋白質(zhì)/同工酶多肽的方法，其特征在于，該方法首先采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)鑒定目標(biāo)性狀的特異蛋白質(zhì)/同工酶帶，接著回收特異帶區(qū)，濃縮成特異帶干粉(聚集)，再通過(guò)IEF電泳系統(tǒng)鑒定區(qū)分特異帶的等電點(diǎn)差異，最后通過(guò)SDS凝膠電泳分離目標(biāo)多肽，使組成特異蛋白質(zhì)/同工酶的多肽完全分離純化，具體包括下列步驟：

步驟一，特異蛋白質(zhì)/同工酶的鑒定分析

采用普通不連續(xù)聚丙烯酰胺活性凝膠系統(tǒng)分析比較對(duì)照與處理間蛋白質(zhì)/同工酶圖譜的差異，確定特異蛋白質(zhì)/同工酶帶，采用的分離膠濃度為7％，濃縮膠濃度為4％，濃縮膠電泳電壓100V，分離膠電泳電壓260V；

步驟二，特異蛋白質(zhì)/同工酶帶回收

采用單向活性凝膠制備系統(tǒng)，不制點(diǎn)樣孔，直接于濃縮膠上上樣分離(聚集)，電泳完畢后切取凝膠板兩側(cè)5-10mm寬的凝膠條染色，染色后放回原凝膠板兩側(cè)指示特異蛋白質(zhì)/同工酶，如果目的帶有多條，而且相互間距離較近，單條回收有困難時(shí)，可將這些目的帶作為一個(gè)區(qū)進(jìn)行回收；根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，確定凝膠回收量；

步驟三，特異蛋白質(zhì)/同工酶干粉制備

根據(jù)染色膠條指示的位置，切取未染色的目的條帶凝膠或帶區(qū)凝膠，放入事先準(zhǔn)備好的透析袋中，向透析袋中加入適量電極緩沖液，封住透析袋口并置于水平電泳槽中，用20mA的恒流過(guò)夜電洗脫，電洗脫完畢后用鑷子取出凝膠，收集蛋白質(zhì)/同工酶粗液，粗液再經(jīng)透析除鹽、真空冷凍干燥后得到粗蛋白質(zhì)/同工酶干粉(聚集)；