[發(fā)明專利]一種大白菜特異蛋白質(zhì)/同工酶的分離純化方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710018761.X
• 申請(qǐng)日: 2007-09-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101168559A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張魯剛;張少麗;惠麥俠;張明科
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K1/14
• 分類號(hào): C07K1/14;C07K4/10
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 李鄭建

1.一種從白菜花蕾中提取分離特異蛋白質(zhì)/同工酶多肽的方法，其特征在于，該方法首先采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)鑒定目標(biāo)性狀的特異蛋白質(zhì)/同工酶帶，接著回收特異帶區(qū)，濃縮成特異帶干粉，再通過(guò)IEF電泳系統(tǒng)鑒定、區(qū)分特異帶的等電點(diǎn)差異，最后通過(guò)SDS凝膠電泳分離目標(biāo)多肽，使組成特異蛋白質(zhì)/同工酶的多肽完全分離純化，具體包括下列步驟：

步驟一，特異蛋白質(zhì)/同工酶的鑒定分析

采用普通不連續(xù)聚丙烯酰胺活性凝膠系統(tǒng)分析比較對(duì)照與處理間蛋白質(zhì)/同工酶圖譜的差異，確定特異蛋白質(zhì)/同工酶帶，采用的分離膠濃度為7％，濃縮膠濃度為4％，濃縮膠電泳電壓100V，分離膠電泳電壓260V；

步驟二，特異蛋白質(zhì)/同工酶帶回收

采用單向活性凝膠制備系統(tǒng)，不制點(diǎn)樣孔，直接于濃縮膠上上樣分離，電泳完畢后切取凝膠板兩側(cè)5-10mm寬的凝膠條染色，染色后放回原凝膠板兩側(cè)指示特異蛋白質(zhì)/同工酶，如果目的帶有多條，而且相互間距離較近，單條回收有困難時(shí)，可將這些目的帶作為一個(gè)區(qū)進(jìn)行回收；根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，確定凝膠回收量；

步驟三，特異蛋白質(zhì)/同工酶干粉制備

根據(jù)染色膠條指示的位置，切取未染色的目的條帶所在位置的凝膠或帶區(qū)凝膠，放入事先準(zhǔn)備好的透析袋中，向透析袋中加入適量電極緩沖液，封住透析袋口并置于水平電泳槽中，用20mA的恒流過(guò)夜電洗脫，電洗脫完畢后用鑷子取出凝膠，收集蛋白質(zhì)/同工酶粗液，粗液再經(jīng)透析除鹽、真空冷凍干燥后得到粗蛋白質(zhì)/同工酶干粉；

步驟四，特異蛋白質(zhì)/同工酶的IEF電泳分離的純化

用制備的粗蛋白質(zhì)/同工酶干粉進(jìn)行IEF凝膠電泳，考馬斯亮蘭染色，驗(yàn)證特異性、檢測(cè)區(qū)分等電點(diǎn)；

步驟五，特異蛋白質(zhì)/同工酶的SDS凝膠電泳分離

挖去IEF凝膠中的目的蛋白質(zhì)帶，進(jìn)行SDS凝膠電泳。采用15％的凝膠濃度，在20×20cm的垂直凝膠板上進(jìn)行，先用5mA恒流預(yù)電泳2小時(shí)，然后將切取IEF目的凝膠條帶放入點(diǎn)樣孔，先用8mA恒流電泳2小時(shí)進(jìn)行濃縮，再用18mA恒流電泳9.5小時(shí)進(jìn)行分離；最后用考馬斯亮蘭染色。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的特異蛋白質(zhì)/同工酶多肽的IEF凝膠電泳，包括：

(1)樣品裂解：以1mg粗蛋白質(zhì)/同工酶干粉，在30ul裂解液進(jìn)行樣品裂解，該裂解液組成：尿素8M，CHAPS4％，DTT65mM，pH為3.5～10的Ampholyte?0.2％；

(2)IEF膠配制：尿素6g，pH為3.5～pH10的Ampholyte?48ul，pH為3.5～7的Ampholyte?240ul，ddH2O?2ml，APS?40ul，TEMED?12ul；

(3)垂直板IEF電泳參數(shù)：200V預(yù)電泳1h，250V電泳30min，280V電泳至電流接近0；

(4)膠條平衡：IEF電泳完畢，用10％的TCA固定10min，然后經(jīng)考馬斯亮蘭染色至顯帶，蒸餾水沖洗，切下目的條帶并將其放入平衡液中平衡25min，直接用于二向凝膠電泳或-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

所述的平衡液為0.125mol/L?Tris-HCl，0.1％SDS。