[發明專利]百合查爾酮合成酶基因（chs）啟動子及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200710018723.4
• 申請日: 2007-09-21
• 公開（公告）號: CN101230347A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發明（設計）人: 劉雅莉;張宗勤;楊麗;常小麗;解燕;祁銀燕
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/52;C12N15/82
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司
• 代理人: 李文義

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種新發現的植物基因組織特異性表達啟動子的DNA序列，特別涉及百合查爾酮合成酶基因(chs)啟動子的DNA序列及其制備方法和含有該啟動子的植物表達載體和其在轉基因植物中的應用。

背景技術

百合是多年生球根花卉，花朵碩大，色彩豐富，花姿優美，既能作切花、盆花，又能在園林綠地中應用。隨著人類經濟和發達程度的不斷提高，人們對百合的觀賞性狀和栽培性狀的要求也越來越高，這使得百合商業育種的進程不斷加快。全世界以荷蘭和美國為中心，培育出了數千個百合新品種。百合切花在荷蘭的排名已上升為第五位，取得球根花卉之王的稱號。在育成的百合新品種中絕大部分采用的是雜交育種的方法。但是，傳統百合雜交育種年限長，遠緣雜交困難，引入某一或某些優良性狀同時往往伴隨著一些不良性狀，通過基因工程引入外來基因可以擴大基因庫，定向修飾花卉某個或某些性狀而保持其他性狀不變；同時由于觀賞植物的特殊性，相對于大田作物來說，安全性方面的要求大大降低，容易被公眾接受。因此，基因工程技術在花卉品種改良和新品種選育方面的應用備受關注。

在基因工程的研究中，采用什么樣的啟動子對外源基因的表達至關重要，組織特異性表達啟動子，如在花、果實和種子等器官中特異表達的啟動子，不僅可以提高外源基因的表達量，而且可將生物能耗降到最低，比組成型啟動子更適應轉基因的各種特殊要求。

花中的主要色素是類黃酮，第一個類黃酮分子是由查爾酮合成酶(Chalcone?sythase，CHS)催化一分子4-香豆酰COA與三分子丙二酸單酰輔酶A縮合形成查爾酮分子的形式形成的，查爾酮分子的異構化和功能基團的進一步取代都能導致黃酮、異黃酮和花色素苷的合成，這些化合物為自然界提供了顏色，并且參與了多種生理過程。查爾酮提供了類黃酮的基本碳骨架，chs表達量的增加或減少都可能導致植物花色的變異。

第一個闡述查爾酮合成酶體外活性的報道是在1972年，是從荷蘭芹懸浮細胞培養物中得到的抽提物。至此，包括單子葉和雙子葉植物的很多物種中，有的物種查爾酮合成酶已經得到純化且基因組、cDNA克隆得到分離，有的或者得到了純化酶，或者分離得到了基因組、cDNA克隆。第一個荷蘭芹的chs序列在1983年被發表，接著更多的序列陸續被發表，截止到目前在GenBank注冊的與chs有關的核酸序列已經有1200多條，主要包括：完整的或者部分的編碼基因，chs相似基因，推測的chs等。涉及的植物主要是豆科的大豆、苜蓿、豌豆，十字花科的擬南芥，禾本科的稻、玉米，葡萄科的葡萄等。在很多植物中，chs的編碼基因組成了一個多基因家族，例如，矮牽牛、豌豆、大豆等(Martin，1993)。目前，雙子葉植物中的查爾酮合成酶已經成為研究的焦點，菜豆中已發現8個chs基因，矮牽牛中鑒定出8個甚至更多chs基因(Koes等，1987；Koes等1989；Ryder等，1987；Durbin等，2000)。盡管Lo和Nicholson在兩色蜀黍(Sorphum?bicolor)中已經分離得到7個查爾酮合成酶基因，(gi(5305906)，gi(5305908)，gi(5305910)，gi(5305912)，gi(5305914)，gi(5305916)，gi(5305918))，但研究表明，在單子葉禾本科植物中的大部分屬(例如，玉米、稻、大麥、黑麥)只含有2個chs基因。

有關chs的表達調控已經在很多植物中得到了研究，已經報道，chs多基因家族中的每個個體都可以被不同的調控方式所調，組織特異性表達，由光、誘導處理、或病原體侵染而誘導的轉錄，及由其他調節基因控制的轉錄。在一些植物的早期發育階段，chs出現在葉片組織中，而成熟植株中主要限于花組織中表達。查爾酮合成酶基因在不同發育階段的、組織特異性的調控，以及誘導調控使它成為一個很好的系統，可以用來研究植物基因調控和表達組織特異性的調控。

chs突變導致表型的變化在很多物種中有過描述，例如金魚草、大麥、番茄、豌豆、玉米。一般chs功能失效會導致花色素譜的缺乏而產生白化花的表型，將反義chs基因轉到矮牽牛中，通過降低chs基因的表達抑制花的色素形成，而產生不同尋常的色素形成方式，包括色素平均分布、花斑、環斑，白色花斑隨機分布在花瓣上，而當一個嵌合的正義chs基因轉入矮牽牛植株中，內源基因和轉入的基因會產生共抑制而導致表型的變異，如花色的改變。國內北京大學邵莉等把chs的植物正義表達載體轉化矮牽牛后，轉基因植物的花色不但發生了明顯的變異，其育性也受到了影響，不能產生正常花粉粒，成為雄性不育植株。