[發明專利]百合查爾酮合成酶基因（chs）啟動子及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 200710018723.4
• 申請日: 2007-09-21
• 公開（公告）號: CN101230347A
• 公開（公告）日: 2008-07-30
• 發明（設計）人: 劉雅莉;張宗勤;楊麗;常小麗;解燕;祁銀燕
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/52;C12N15/82
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司
• 代理人: 李文義

1.百合查爾酮合成酶基因(chs)啟動子，它的核苷酸序列如序列表SEQ?IDNO.1所述。

2.制備權利要求1所述的百合查爾酮合成酶基因(chs)啟動子的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)百合葉片基因組DNA的提取

將東方百合“Sorbonne”幼嫩葉片0.5-2.0g在液氮中研磨后放入2ml離心管，并加入1×CTAB?buffer(760ul)，PVP?20％(140ul)和β-巰基乙醇(20ul)，65℃水浴20～40min，再加入等體積氯仿-異戊醇，12000rpm離心20～40min，并重復一次；取上清放在5ml離心管中，緩慢加入1/10體積無水乙醇(-20℃預冷)，1/5體積CTAB?buffer，NaCl(25ul?5M)，和1/10體積KA_C(5M預冷)混勻，在冰上冷凍20～40min；在-4℃，7000rpm離心10～15min后加入1×CTAB?buffer(1000ul)，65℃，水浴20～40min；加25ul飽和NaCl和800ul氯仿-異戊醇(24∶1)12000rpm，離心10～20min；取沉淀，加入550ul?TE和RNase，在37℃，水浴30～40?min后加入2倍無水乙醇(-20℃預冷)輕柔的顛倒混勻，20～40min后挑出DNA；

加入1ml?70％酒精洗滌2次，在超凈工作臺上晾干，加入50ul雙蒸水溶解，-30℃保存備用；

2)基因組DNA經粘末端酶酶切

酶切體系如下：

基因組DNA????????????????????5.0ul(1ug/ul)

EcoR?I/HindIII/SaII/Sau3A????10.0ul(10u/ul)

內切酶10×Buffer????10.0ul

ddH₂O???????????????75.0ul補齊至100ul

37℃酶切16-24h后取10ul在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳檢測酶切是否徹底，酶切徹底后，65℃滅活10～30min，加入等體積的氯仿-異戊醇，12000rpm抽提一次，上清用2倍無水乙醇(-20℃預冷)，-20℃下沉淀20～40min，12000rpm，離心10～30min，最后加10ulddH₂O溶解，取2ul測定DNA濃度，調節DNA濃度至0.5ug/ul；

3)接頭與相應的酶切基因組連接

接頭由試劑盒提供，連接反應體系：

酶切基因組DNA(0.5ug/ul)????1.5ul

相應的接頭?????????????????4.0ul

Ligation?solution?I????????15.0ul

Ligation?solution?II???????7.5ul

ddH2O??????????????????????22.0ul補齊至50ul

將該反應體系混勻后，在16℃條件下反應30～60min，然后65℃滅活10～20min，放在4℃備用；

4)回收酶切后的基因組片段

回收酶切后的基因組片段，在片段兩端加上相應的酶切接頭，且接頭中含有兩個擴增引物C1和C2；

PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳后，用天為時代的回收試劑盒回收目的片段；

采用TaKaRa公司的接頭連接PCR試劑盒：TakaRa?LA?PCRTM?in?VitroCloning?Kit，接頭引物由試劑盒提供，序列如下：

Cassette?Primer?C1：5′CTT?ACA?TAT?TgT?CgT?Tag?AAC?gCg?TAA?TAC?gAC?TCA′3

Cassette?Primer?C2：5′CgT?Tag?AAC?gCg?TAA?TAC?gAC?TCA?CTA?Tag?ggA?gA′33)

5)用兩個接頭引物和基因的兩個特異引物GSP1和GSP2，GSP3和GSP4構成兩組特異引物進行兩輪巢式PCR擴增，兩次步移：

第一次步移的下游引物是根據查耳酮合成酶基因的cDNA片段設計的，序列如下：

GSP1：5’ggA?CCT?CgA?CTA?CCA?CCA?TAT?CCT?g’3

GSP2：5’CCA?TgT?Agg?CgC?ACA?TAT?Tgg?ggT?TC3

接頭連接PCR反應的體系及程序如下：

反應成份

第一輪PCR(25ul)??????????????第二輪PCR(50ul)

連接產物????????????0.5ul????第一輪PCR產物稀釋100×???1.0ul

10×LAPCR?Buffer????2.5ul????10×LAPCR?Buffer?????????5.0ul

2.5Mm?dNTPs?????????4.0ul????2.5mM?dNTPs??????????????8.0ul

接頭引物C1(10uM)????0.5ul????接頭引物C2(10uM)?????????1.5ul

GSPl(10uM)??????????0.5ul????GSP2(10uM)???????????????1.5ul

LATaq???????????????0.3ul????LA?Taq???????????????????0.7ul

ddH₂O???????????????16.7ul???ddH₂O????????????????????32.3ul

石蠟油??????????????10.0ul???石蠟油???????????????????15.0ul

反應條件：95℃預變性10min；加入LA?Taq酶0.3ul，94℃30s、72℃4min，5cycles，94℃30s、70℃4min，5cycles，94℃30s、68℃4min，5cycles，94℃30s.67℃4min，20cycles；72℃延伸10min；4℃終止反應；

第二次染色體步移

分別以C1和C2及在第一次步移基礎上設計的特異引物GSP3和GSP4進行兩輪巢式PCR，在HindHI文庫里發現了特異條帶并將其回收克隆，然后以質粒為模板，分別以雙引物和單引物為對照，進行PCR擴增；

所述的特異引物GSP3和GSP4序列如下：

GSP3：5’gTC?ggA?CTg?gTA?gAT?gAT?gTT?gg?3’

GSP4：5’TTg?gAC?Tgg?gAg?ggT?gAg?gAA?gAg?C3’

將兩次步移的測序結果去掉接頭引物部分后，進行拼接，全長為1243bp，其中ATG為起始密碼子，5’非翻譯區長為899bp，如序列表SEQ?ID?NO.1所述。