[發(fā)明專利]魚類異源冷凍精子誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710016988.0
• 申請日: 2007-08-28
• 公開（公告）號: CN101120660A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳松林;楊景峰;蘇鵬志;翟介明;田永勝;廖小林;邵長偉
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: A01K61/00
• 分類號: A01K61/00;C12N5/06;C12N15/06;C12Q1/68;A61D19/02
• 代理公司: 青島聯(lián)智專利商標事務(wù)所有限公司
• 代理人: 袁和善

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于魚類遺傳育種技術(shù)，是一種采用異源冷凍精子培育魚類雌核發(fā)育二倍體的方法，可應(yīng)用于魚類性別控制和全雌苗種的生產(chǎn)。

背景技術(shù)：

許多魚類在生長速率上存在雌雄差異。例如，羅非魚雄性個體生長比雌性個體快50％以上，而許多海水鲆鰈魚類的雌性個體生長比雄性個體快許多，如星鰈和大西洋牙鲆等鲆鰈魚類雌性個體生長比雄性個體快50-100％。由于雄性個體生長過慢，降低了這些鲆鰈魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)量和養(yǎng)殖效益，增加了養(yǎng)殖成本，嚴重影響了這些魚類苗種的推廣和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的形成，因此，對這些魚類開展雌核發(fā)育技術(shù)的研究、研制全雌群體，在漁業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用全雌苗種，對于提高這些魚類的養(yǎng)殖產(chǎn)量和商品價值，非常重要，同時，全雌苗種的推廣必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟和社會效益。

雌核發(fā)育是單性生殖的一種，指卵子依靠自身的遺傳物質(zhì)發(fā)育成個體的生殖行為。雌核發(fā)育現(xiàn)象最早發(fā)現(xiàn)于天然魚類阿馬遜花鳉(Poeciliaformosa)，分布于我國的方正銀鯽、彭澤鯽等也屬于天然雌核發(fā)育魚類。

目前國內(nèi)，對銀鯽天然雌核發(fā)育機理進行了大量的研究(中國科學院水生生物研究所，桂建芳等，1996)，最早在鯉魚上建立了雌核發(fā)育技術(shù)(中國科學院水生生物研究所，吳清江，1981)；迄今，在淡水魚類雌核發(fā)育的研究中，通常采用同源新鮮精液進行刺激，誘導(dǎo)雌核發(fā)育二倍體的產(chǎn)生(中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，潘光碧等，1995)。但由于同源精子來源于同一種魚類，其染色體數(shù)量相同，因而同源精子誘導(dǎo)存在精子失活不完全、雌核發(fā)育苗與正常受精來源的魚苗難以鑒別等問題，因而影響了雌核發(fā)育技術(shù)的應(yīng)用效果，影響了全雌魚類苗種的培育。因此，探索采用染色體數(shù)量不相同的異源魚類精子進行魚類雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，將具有更大的實用性和應(yīng)用價值。

由于不同魚類的繁殖期不同，所以很難采用異源魚類的新鮮精液進行雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，因此，我們采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，對異源魚類精子進行冷凍保存，待需要時進行解凍，用于魚類卵子雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，則可以克服上述諸多問題，使魚類雌核發(fā)育變得簡便易行，有利于進行推廣應(yīng)用，因而成為國際上的發(fā)展趨勢。有關(guān)魚類異源冷凍精子誘導(dǎo)的雌核發(fā)育研究，目前國內(nèi)外均未見報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是采用遺傳失活的異源冷凍精子誘導(dǎo)魚類卵子進行雌核發(fā)育，并在適宜的時期對授精卵進行染色體加倍處理，以阻止卵的第二極體排出，使雌核發(fā)育卵的染色體加倍，發(fā)育成具有活力的雌核發(fā)育二倍體魚苗。

本發(fā)明其技術(shù)內(nèi)容如下：

包括三個方面：一、異源魚類冷凍精子的遺傳失活；二、雌核發(fā)育二倍體魚苗的誘導(dǎo)；三、雌核發(fā)育魚苗的鑒定。

一、異源魚類冷凍精子的遺傳失活：它的技術(shù)內(nèi)容包括：1、適宜的異源精子的選擇；2、異源精子的冷凍保存和解凍；3、異源冷凍精子的遺傳失活：

1、適宜的異源魚類精子的選擇：

首先，通過染色體分析比較，盡量選取染色體數(shù)量不同的魚類精子作為雌核發(fā)育用精子；其次，采用多種魚類精子分別同擬誘導(dǎo)雌核發(fā)育的魚類卵子進行雜交授精，觀察受精卵的發(fā)育情況，尋找可以與鲆鰈魚類(條斑星鰈、大菱鲆等)卵受精后胚胎可以發(fā)育至原腸胚、并且受精率較高的魚類精子。通過這種篩選方法，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)花鱸(染色體數(shù)為48條)精子可以刺激多種鲆鰈魚類(條斑星鰈染色體為46條，大菱鲆染色體為44條)卵子進行雌核發(fā)育。

2、異源精子的冷凍保存和解凍：

在繁殖季節(jié)，選取發(fā)育成熟的花鱸雄魚，用手擠壓腹部采集無尿污的精液，利用顯微鏡檢查精子的活力，選擇精子活力在80％以上的精液用于冷凍保存。將精液與4℃預(yù)冷的冷凍稀釋液(配方為KCl?0.39g/L，CaCl₂·2H₂O?0.17g/L，NaHCO₃?0.25g/L，NaCl?3.59g/L，NaH₂PO₄?0.22g/L，MgCl₂?0.23g/L，Glucose?1.0g/L，DMSO?20％)，以體積比1∶1的比例混合后，分裝到2.0ml的冷凍保存管，在4℃冰箱平衡20分鐘后，放入液氮罐口下平衡5分鐘，再在液氮面上平衡5分鐘，最后浸入液氮中冷凍保存。解凍時，將精液冷凍管從液氮中取出來，先在液氮面上平衡5分鐘，然后將凍精管拿出來在38℃水浴中解凍后備用。

3.異源冷凍精子遺傳物質(zhì)的失活：