[發明專利]魚類異源冷凍精子誘導雌核發育的方法

無效

• 申請號: 200710016988.0
• 申請日: 2007-08-28
• 公開（公告）號: CN101120660A
• 公開（公告）日: 2008-02-13
• 發明（設計）人: 陳松林;楊景峰;蘇鵬志;翟介明;田永勝;廖小林;邵長偉
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: A01K61/00
• 分類號: A01K61/00;C12N5/06;C12N15/06;C12Q1/68;A61D19/02
• 代理公司: 青島聯智專利商標事務所有限公司
• 代理人: 袁和善

1.一種異源冷凍精子誘導魚類雌核發育的方法，其特征在于它的操作方法包括：1)、異源魚類冷凍精子的遺傳失活；2)、雌核發育二倍體魚苗的誘導；3)、雌核發育魚苗的鑒定：

1)、異源魚類冷凍精子的遺傳失活：通過染色體分析比較和雜交授精實驗確定花鱸精子可以有效刺激多種鲆鰈魚類卵子進行雌核發育，為誘導鲆鰈魚類卵子進行雌核發育的有效異源魚類精子；采用配方為KCl0.39g/L，CaCl₂·2H₂O?0.17g/L，NaHCO₃?0.25g/L，NaCl?3.59g/L，NaH₂PO₄?0.22g/L，MgCl₂?0.23g/L，Glucose?1.0g/L，DMSO?20％的冷凍稀釋液對花鱸精子進行冷凍保存；花鱸精液在液氮中可以進行長期冷凍保存；解凍時，將在液氮中保存的冷凍精液管從液氮中取出來，先在液氮面上平衡5分鐘，然后將凍精管拿出來在38℃水浴中解凍后備用；冷凍精子的遺傳失活采用紫外線照射完成；選取解凍后精子活力在60-70％以上者用于紫外線失活處理；吸取100μL冷凍解凍的花鱸精液置于在6℃預冷過的直徑為10cm的培養皿中，加入900μL不合DMSO的上述精子冷凍稀釋液進行稀釋，搖勻平輔在直徑10厘米的塑料培養皿底部，將裝有冷凍精液的培養皿置于10-80mJ/cm²紫外線下照射0.1-0.9min，照射后的精子活力應該保持在20-40％，經這樣處理過的精子可以用來誘導魚卵雌核發育；

2)、雌核發育二倍體魚苗的誘導：選擇性成熟的條斑星鰈、大菱鲆或犬齒牙鲆等鲆鰈魚類雌魚，在自然產卵前1h采用人工擠壓腹部法采卵，將卵采入干燥的燒杯中，根據魚的種類不同，將采集的魚卵置于不同的溫度下，其中條斑星鰈卵放在8℃，大菱鲆卵放在14℃，犬齒牙鲆卵放在18℃；將以上經過紫外線照射失活的花鱸精液分別加入到條斑星鰈、大菱鲆、犬齒牙鲆魚的未受精卵中，輕輕搖動混勻，加入2倍于卵量的海水完成“授精”過程，海水溫度根據魚的種類確定，其中條斑星鰈卵授精溫度為8℃，大菱鲆卵放在為14℃，犬齒牙鲆卵放在18℃；精液和卵的“授精”最小體積比100μL精液：4-8ml卵，授精過程在250ml燒杯中進行；在授精后不同時間，對受精卵進行冷休克處理；通過大量實驗確定適合于我國幾種重要海水魚類雌核發育卵染色體加倍的誘導條件分別為：

條斑星鰈：在用紫外線失活的花鱸精子與條斑星鰈卵子“授精”后7-9分鐘，將授精卵放在-0.5℃到-1.5℃的水浴中進行冷休克處理，處理時間為60-90min，然后將授精卵置于8℃左右的海水中進行孵化，能夠獲得雌核發育的二倍體條斑星鰈魚苗，二倍體雌核發育魚苗的誘導率為7.8-40.7％；

大菱鲆：在用紫外線失活的花鱸精子與大菱鲆卵子“授精”后4-6分鐘，將授精卵放在溫度為-1-2℃的水浴中進行冷休克處理，冷休克的持續時間為20-30分鐘。然后將授精卵置于14℃左右的海水中進行孵化，能夠獲得雌核發育的二倍體大菱鲆魚苗；二倍體雌核發育魚苗的誘導率為26-34％；

犬齒牙鲆：在用紫外線滅活的花鱸精子與犬齒牙鲆卵子“授精”后3-5分鐘，將授精卵放在溫度為1-2.0℃的水浴中進行冷休克處理，冷休克的持續時間為40-50分鐘；然后將授精卵置于18℃左右的海水中進行孵化，能夠獲得雌核發育的二倍體犬齒牙鲆魚苗；二倍體雌核發育魚苗的誘導率為10-25％；

3)、雌核發育魚苗的鑒定：

染色體分析鑒定雌核發育魚苗：

由于花鱸染色體數目為2n＝48條，其核型為48t，而條斑星鰈染色體數目為2n＝46，其核型為44t+2sm；而大菱鲆染色體數目為2n＝44，其核型為2n＝4m+12st+28t，因此花鱸的染色體數目與這些魚類不相同，通過染色體分析即可證明雌核發育魚苗是否為雌核發育而來；如果雌核發育魚苗的染色體數目及核型與條斑星鰈、大菱鲆或犬齒牙鲆等母本相同，則證明這些魚苗是雌核發育而來；本發明采用染色體制片技術，對條斑星鰈和大菱鲆等魚類雌核發育魚苗進行了染色體分析，發現條斑星鰈雌核發育魚苗的染色體數為46條，大菱鲆雌核發育魚苗的染色體數為44條，與母本完全相同，從而證明這些魚苗為雌核發育二倍體個體；

用微衛星標記鑒定雌核發育魚苗：

基因組DNA的提取：將固定于純酒精中的魚苗或魚鰭條剪碎后加入400μl配方為10mM?Tris-HCl，pH7.5，400μM?NaCl，100mM?EDTA，0.6％SDS10mM?Tris-HCl，PH7.5，400μM?NaCl，100mM?EDTA，0.6％SDS的TENS裂解液和10μl濃度為10mg/ml的蛋白酶K，55℃消化完全后，加入140μl飽和氯化鈉，混勻，12000rpm/min?4℃離心30min；取上清加入兩倍體積預冷的無水乙醇沉淀DNA，然后將絮狀沉淀挑出后用70％的酒精洗滌兩次，待酒精揮發干后，用TE緩沖液溶解DNA；

PCR擴增及結果分析：PCR反應體系為10μl，包括配方為20mM?Tris-HCl，pH8.4，20mM?KCl，10mM硫酸銨，10-50ng基因組DNA，0.2μM微衛星引物，120μMdNTPs，1.5mM?MgCl₂和0.5U?Taq?DNA聚合酶；PCR擴增條件為94℃熱變性5min，然后進行38個循環，每個循環包括94℃變性30s，56-62℃退火30s，72℃延伸30s，最后在72℃延伸7min；采用序列為CGAGGAGGGGAAGAAAGAAC和CACAACCCAAGCGCAACTAT的Pade?30微衛星引物，擴增普通犬齒牙鲆基因組DNA時，85％以上的個體擴增出2條DNA帶，而當擴增犬齒牙鲆雌核發育魚苗時，75％以上個體只擴增出1條帶；當用序列為CACTGTGCCCACTGTCTG和TTTTCCTCTT?ACTCCCTCTCTT的Vmo4微衛星引物擴增普通條斑星鰈基因組DNA時，75％以上的個體擴增出2條DNA片段，而當擴增條斑星鰈雌核發育魚苗基因組DNA時，90％以上的個體只擴增出1條DNA片段；采用序列為TGGACTGGTTTACTGCTGGA和AGGGAACCGATCTGAGAACA的SmaC03微衛星引物擴增正常大菱鲆魚苗時，85％以上的個體產生2條DNA帶，而當擴增雌核發育大菱鲆魚苗時，75％以上的個體只產生1條DNA帶；因此，這些微衛星標記可以用于鑒定這些魚類雌核發育魚苗。