[發(fā)明專利]一種適用于飼料的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200710016892.4
• 申請(qǐng)日: 2007-07-20
• 公開（公告）號(hào): CN101319996A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉梅;王雷;陶冉;王寶杰;蔣克勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
• 主分類號(hào): G01N21/77
• 分類號(hào): G01N21/77;G01N27/447
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

1.一種適用于飼料的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)試劑盒，其特征在于：

1)第一次PCR反應(yīng)液體系：PCR反應(yīng)緩沖液22.5μl、引物F20.5μl、引物R2?0.5μl，Taq?DNA聚合酶0.5μl；

2)第二次PCR反應(yīng)液體系：PCR反應(yīng)緩沖液22.5μl、引物F30.5μl、引物R3?0.5μl、Taq?DNA聚合酶0.5μl；

其中，第一次PCR反應(yīng)引物為：

F2：5’-CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3’；R2：5’-CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3’；

第二次PCR反應(yīng)引物為：

F3：5’-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3’；R3：5’-CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3’；

第一次PCR和第二次PCR反應(yīng)液體系中PCR反應(yīng)緩沖液含有：10mMTris-HCI，pH8.3；50mM?KCI、1.5mM?MgCI2、dNTP?0.2mM；

3)陽(yáng)性對(duì)照DNA?1μl；

所述陽(yáng)性對(duì)照DNA為轉(zhuǎn)基因大豆DNA。

2.一種按權(quán)利要求1所述的適用于飼料的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于：

1)提取模板DNA：

稱取1-10g轉(zhuǎn)基因大豆的原料，加入10-100ml預(yù)冷的提取緩沖液混勻；加入預(yù)熱60-70℃的裂解緩沖液混勻；60-70℃溫育30-60min；冷卻后加入5-50ml氯仿、異戊醇和乙醇的混合液混勻，室溫放置3-10分鐘；而后在10000-13000rpm離心8-15min，取上清液并在上清液中加入5-50ml酚和氯仿混合液混勻，室溫放置3-10分鐘；再以10000-13000rpm離心8-15min取上清液；上清液中加入其體積2/3的預(yù)冷異丙醇，-20--40℃放置20-30min，10000-13000rpm離心10-15min，即得到提取模板DNA，待用；

2)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)：

步驟1)得到的DNA模板液取1μl加入PCR反應(yīng)緩沖液，并加入引物F2和R2各0.5μl以及TaqDNA聚合酶0.5μl，混合均勻，而后在94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；得到第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，取1μl第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入無(wú)菌雙蒸水進(jìn)行50-100倍稀釋，而后取1μl稀釋液加入PCR反應(yīng)液緩沖液中，并加入引物F3和R3各0.5μl以及TaqDNA聚合酶0.5μl，混合均勻，以上述PCR反應(yīng)條件進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

F2：5’-CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3’；R2：5’-CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3’；

F3：5’-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3’；R3：5’-CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3’；

將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和紫外光檢測(cè)結(jié)果，如果存在250bp的DNA條帶，證明所檢測(cè)的原料中含有轉(zhuǎn)基因大豆；

所述步驟1)中提取的模板DNA沉淀在體積濃度為70％乙醇中洗滌1-2次，晾干后，溶于500-1000μl雙蒸水中，待用。

3.按權(quán)利要求2所述的適用于飼料的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟1)中異戊醇、乙醇和氯仿的體積比為4∶20∶76；酚和氯仿體積比為1∶1；提取緩沖液為0.8M?NaCI；50M?Tris-CI，10mM?EDTA；pH8.0；裂解緩沖液為0.8M?NaCI；50M?Tris-CI，10mM?EDTA；20％CTAB；pH8.0。

4.按權(quán)利要求2所述的適用于飼料的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于：所述預(yù)冷的異丙醇預(yù)冷溫度為4℃。