[發明專利]一種適用于飼料的轉基因大豆檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 200710016892.4
• 申請日: 2007-07-20
• 公開（公告）號: CN101319996A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 劉梅;王雷;陶冉;王寶杰;蔣克勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: G01N21/77
• 分類號: G01N21/77;G01N27/447
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及轉基因作物，具體的說是一種適用于飼料的轉基因大豆檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術

轉基因作物是指利用重組DNA技術將外源基因整合于受體植物基因組、改變其遺傳組成后產生的植物及其后代，也稱為遺傳修飾生物體(Genetically?modified?organisms，GMOs)。自1983年首例轉基因植物問世以來，全球轉基因作物的種植面積和銷售收入均以倍數增長。但從嚴肅的科學意義上說，轉基因農產品的生物安全性目前尚無確定的結論。人類關注轉基因食品安全的同時，也關注著動物飼料的安全。飼料安全是食品安全的一個重要環節，轉基因飼料的安全性檢測也將為相應轉基因食品的安全性提供有力的證據。我國的飼料生產已經具有相當規模，飼料中常用的原料有大豆、豆粕、棉籽粕、玉米菜籽粕等，這些可能含有轉基因的作物有對動物、人體和生態環境存在不可知的危害。到目前為止，尚未見關于對飼料進行轉基因檢測的專利技術。

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有高度靈敏性的適用于飼料的轉基因大豆檢測方法及檢測試劑盒。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

試劑盒：

1)第一次PCR反應液體系：PCR反應緩沖液22.5μl、引物F2?0.5μl、引物R2?0.5μl，Taq?DNA聚合酶0.5μl；

2)第二次PCR反應液體系：PCR反應緩沖液22.5μl、引物F30.5μl、引物R3?0.5μl、Taq?DNA聚合酶0.5μl；

其中，第一次PCR反應引物為：

F2：5’-CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3’；R2：5’-CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3’；

第二次PCR反應引物為：

F3：5’-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3’；R3：5’-CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3’；

第一次PCR和第二次PCR反應液體系中PCR反應緩沖液含有：10mMTris-HCI，pH8.3；50mM?KCI、1.5mM?MgCI2、dNTP?0.2mM；

3)陽性對照DNA?1μl。

所述陽性對照DNA為轉基因大豆DNA。

檢測方法：

1)提取模板DNA：

稱取1-10g轉基因大豆的原料，加入10-100ml預冷的提取緩沖液混勻；加入預熱60-70℃的裂解緩沖液混勻；60-70℃溫育30-60min；冷卻后加入5-50ml氯仿、異戊醇和乙醇的混合液混勻，室溫放置3-10分鐘；而后在10000-13000rpm離心8-15min，取上清液并在上清液中加入5-50ml酚和氯仿混合液混勻，室溫放置3-10分鐘；再以10000-13000rpm離心8-15min取上清液；上清液中加入其體積2/3的預冷異丙醇，-20--40℃放置20-30min，10000-13000rpm離心10-15min，即得到提取模板DNA，待用；

2)進行轉基因檢測：

步驟1)得到的DNA模板液取1μl加入PCR反應緩沖液，并加入引物F2和R2各0.5μl以及TaqDNA聚合酶0.5μl，混合均勻，而后在94℃預變性2min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環，最后72℃延伸10min；得到第一次PCR擴增產物，取1μl第一次PCR擴增產物加入無菌雙蒸水進行50-100倍稀釋，而后取1μl稀釋液加入PCR反應液緩沖液中，并加入引物F3和3各0.5μl以及TaqDNA聚合酶0.5μl，混合均勻，以上述PCR反應條件進行第二輪擴增，得到擴增產物；

F2：5’-CATTTGGAGAGGACACGCTGACA-3’；R2：5’-CCGGAAAGGCCAGAGGATT-3’；

F3：5’-TAACAACATGGCACAAGGGATACA-3’；R3：5’-CAGAGGATTTGCGGGCGGTTGC-3’；

將擴增的產物進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外光檢測結果，如果存在250bp的DNA條帶，證明所檢測的原料中含有轉基因大豆。