[發(fā)明專利]一種組織工程化骨復(fù)合體及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710016803.6
• 申請日: 2007-07-09
• 公開（公告）號: CN101085374A
• 公開（公告）日: 2007-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙冬梅;王海斌;劉軍莉;趙萍;赫淑倩;霍延青;司海朋
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號: A61L27/40
• 分類號: A61L27/40;A61L27/38
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 李健康

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程中組織工程方法構(gòu)建人工骨技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種組織工程化骨復(fù)合體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

在生命活動中由外傷、感染、腫瘤及先天性疾病等原因造成的骨缺損十分常見，尤其肢體創(chuàng)傷所造成的骨缺損發(fā)病率高達(dá)10％，骨缺損的治療和修復(fù)是骨科臨床常見的難癥之一。已有研究表明長管狀骨骨干的直徑?jīng)Q定了骨缺損能否自行愈合的長度，當(dāng)骨干骨缺損長度超過其直徑的1.5～2.5倍時(shí)即難以自行愈合，需要植骨材料修復(fù)，但目前臨床使用的骨修復(fù)材料因各有利弊，不能達(dá)到修復(fù)骨缺損理想材料的要求。

近年來隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建有生命活性的組織工程化復(fù)合材料的研究有了一定的進(jìn)展，這無疑將會對臨床治療骨缺損帶來重大的科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。但對如何構(gòu)建理想的骨組織工程復(fù)合材料及其制備和應(yīng)用，即如何制備得到良好的骨替代材料，并使其與種子細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，同時(shí)以何方式添加信號因子等具體方法的研究還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種組織工程化骨復(fù)合體及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明旨在利用納米技術(shù)和三維造孔技術(shù)，將納米羥基磷灰石和羧甲基殼聚糖制備成一種與天然松質(zhì)骨類似的三維孔洞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成多孔狀、孔隙率高、力學(xué)性能好的納米人工骨基質(zhì)材料，并以人工骨支架標(biāo)準(zhǔn)模具或設(shè)定的模具制備成人工骨支架，然后將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular?endothelial?growth?factor，VEGF)基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone?marrow?strone?cell，BMSCs)并植入此人工骨支架內(nèi)，構(gòu)建組織工程骨復(fù)合體，最終目的實(shí)現(xiàn)在所需的解剖部位或骨缺損部位激發(fā)成骨，并使新骨與周圍健康骨在結(jié)構(gòu)上整合在一起，同時(shí)可根據(jù)生理活動中所承受的負(fù)荷進(jìn)行重塑，成為能終身發(fā)揮功能的自身骨的一部分。

本發(fā)明的組織工程化骨復(fù)合體，其特征是：所述骨復(fù)合體由呈多孔狀且孔徑間貫通的人工骨支架及植入孔中的轉(zhuǎn)染有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組成；其中，所述人工骨支架由質(zhì)量比為6～7∶4～3的納米羥基磷灰石與羧甲基殼聚糖制成，其孔隙率為65％～75％，孔徑尺寸2微米～600微米，以圓形為主；所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ATCC?NO.CRL-2496或兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；所述血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子基因是人基因VEGF165或兔基因VEGF165。

其中：所述人工骨支架優(yōu)選由質(zhì)量比為3∶2的納米羥基磷灰石與羧甲基殼聚糖制成，其孔隙率為70％～75％，孔徑尺寸200微米～450微米；所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；所述血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子基因優(yōu)選兔基因VEGF165。

上述兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由下述方法分離與培養(yǎng)：

體重1.5±0.3kg新西蘭大白兔，無菌條件下抽取其髂骨骨髓3±0.5ml，DME/F-12培養(yǎng)液沖洗，離心1000r×5min，棄上清液，DME/F-12培養(yǎng)液重懸制成單細(xì)胞懸液；血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以5×10⁵個(gè)/ml密度接種于50ml玻璃細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h～48h后倒置顯微鏡下觀察；0.25％胰酶消化原代細(xì)胞3min，以1×10⁵個(gè)/ml按1∶2比例傳代接種培養(yǎng)；取部分細(xì)胞以1×10³個(gè)/ml接種于24孔培養(yǎng)板中，每天隨機(jī)取3個(gè)孔細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為縱標(biāo)，天數(shù)為橫標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

本發(fā)明所述組織工程化骨復(fù)合體的構(gòu)建方法，步驟是：

(1)將納米羥基磷灰石與羧甲基殼聚糖按質(zhì)量比為6～7∶4～3的比例分別配料，以機(jī)械球磨使其充分混合；再按納米羥基磷灰石/羧甲基殼聚糖復(fù)合粉體與對二氯苯按質(zhì)量比為1∶1～1.2的比例稱料，研磨混合，然后超聲振蕩2h～3h，使其充分混勻；向混合料中加入質(zhì)量百分比為16.7％的檸檬酸溶液并調(diào)和均勻，檸檬酸溶液用量以混合料能可塑成形為準(zhǔn)；將成形混合料放入人工骨支架標(biāo)準(zhǔn)模具或依目的設(shè)定的模具中，加壓成形，保壓60s～100s；脫模，先將成形復(fù)合材料在空氣中放置4h～5h，再置于無水乙醇中，超聲振蕩8h～10h，之后于80℃烘干3h～5h，得人工骨支架；