[發明專利]番茄灰霉病拮抗菌株B－04－glu

有效

• 申請號: 200710014340.X
• 申請日: 2007-04-16
• 公開（公告）號: CN101289649A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發明（設計）人: 馬匯泉;李桂霞
• 申請（專利權）人: 山東理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/56;A01N63/02;A01P3/00;C12R1/085
• 代理公司: 淄博科信專利商標代理有限公司
• 代理人: 吳紅

所屬技術領域

本發明涉及一種菌株，具體是涉及一種番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu。

技術背景

灰霉病是由半知菌亞門灰葡萄孢屬(Botrytis?cinerea?Pers)真菌侵染所致，是一種世界性重 要病害。不僅對番茄的危害越來越重，而且目前已成為番茄、黃瓜、茄子、西葫蘆、菜豆、 萵筍、生菜、韭菜等蔬菜的主要病害，目前在生產上對番茄灰霉病的防治主要依靠噴灑化學 農藥，現在具有較高活性的新型化學農藥主要有嘧啶胺類、吡咯類以及酰胺類等。但若連續 使用化學藥劑，病菌會逐漸產生了抗藥性，防效逐年下降，而且化學農藥影響番茄品質、污 染環境、影響人類健康。

發明內容

本發明的目的是提供一種不含有化學農藥的嘧啶胺類、吡咯類以及酰胺類等成份、能對 治療番茄灰霉病具有良好應用效果的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu。其技術方案為：

番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，其特征在于包括以下四個步驟：步驟1從感染灰霉病的 土壤樣品中篩選到一株拮抗灰霉病的蠟樣芽孢桿菌，該細菌命名為B-04(公開記載在《山東 農業科學》第2007年第2期P69-72頁中李桂霞等“番茄灰霉病高效拮抗菌株鑒定及抗菌活 性研究”一文中)；步驟2培養含有B-04細菌的菌液；步驟3依次用超純水、1mM?Hepes、 電擊緩沖液洗；步驟4通過電擊的方法將β-1，3-葡聚糖酶基因轉化到B-04細菌內，獲得拮抗 菌株B-04-glu。

所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步驟2中：將單個B-04細菌菌落接種到LB培養 基中，于26～32℃搖床劇烈振蕩培養6～20h，然后將生成的菌懸液與LB培養基按1∶10的 比例接種，再于26～32℃搖床劇烈振蕩培養至對數生長期2～3.5h。

所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步驟3中：將步驟2最終獲得的菌液先冰浴20～ 40min，然后離心收集菌體，將收集的菌體依次用預冷的超純水洗至少1～3次，用濃度為 1mM、pH為7.0的Hepes洗1～3次，用濃度為1mM的Hepes、含甘油10％且pH為7.0 的電擊緩沖液洗1～3次，然后懸浮到1.0～2.0ml電擊緩沖液中，分裝成每管100μl，儲藏于 -70℃的冰箱中。

所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，步驟4中：電擊轉化時取一管菌液放在冰上溶解， 溶解后加入5～10μl質粒DNA，冰上放置2～10min后轉移到電擊轉化杯中，電擊條件為800～ 1800V、電容25～50uF、電阻100～400Ω、電擊杯內徑2mm，電擊后將其菌液加入到500μl～ 1.5ml?LB培養基中，在37℃培養0.5～24h后，取100μl菌液涂在含有相應抗生素的平板上， 于26～32℃培養6～24h，即獲得拮抗菌株B-04-glu。

所述的番茄灰霉病拮抗菌株B-04-glu，以B-04為出發菌株，用β-1，3-葡聚糖酶基因構建 工程菌B-04-glu，β-1，3-葡聚糖酶基因從質粒pUC1940中酶切獲得。

其工作原理為：B-04細菌本身有較強的抗番茄灰霉病的功能，β-1，3-葡聚糖酶又能導致 菌絲細胞壁破裂，原生質體外泄，從而殺死病原菌，因此通過電擊的方法將β-1，3-葡聚糖酶 基因轉化到B-04細菌內，獲得的拮抗菌株B-04-glu與野生菌株相比，能大大提高了防治番 茄灰霉病的能力。

本發明與現有技術相比，由于是生物防治，不含有化學農藥的嘧啶胺類、吡咯類以及酰 胺類等成份，所以具有無毒、不污染環境、不易產生抗藥性、無殘留、易生產、持效期長、 治病力強、應用效果好、對非靶標生物安全等優點，具有廣闊的應用前景。

具體實施方式

實施例1：

步驟1：從感染灰霉病的土壤樣品中篩選到一株拮抗灰霉病的蠟樣芽孢桿菌，即B-04細 菌；

步驟2：將單個B-04細菌落接種到LB培養基中，于30℃搖床劇烈振蕩培養20h，然后 將生成的菌懸液與LB培養基按1∶10的比例接種，再于30℃搖床劇烈振蕩培養至對數中期 約3h；