[發明專利]CRM197突變體的純化方法

無效

• 申請號: 200710013378.5
• 申請日: 2007-03-13
• 公開（公告）號: CN101265288A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 王克波;孫麗霞;董婷;張薛;徐同文;王晶翼
• 申請（專利權）人: 齊魯制藥有限公司
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K14/195;C12N1/21;C12N15/33
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司
• 代理人: 王緒銀

技術領域

本發明涉及利用重組DNA技術生產基因工程藥物，具體涉及大腸桿菌表達的CRM197突變體的純化方法，屬于醫藥技術領域。

背景技術

CRM197(cross-reacting?forms?of?toxin?197)是白喉毒素喪失了毒性的一種突變體，它是由野生型白喉毒素的堿基序列中由一個堿基G突變為A，從而導致了第52位氨基酸GLY突變為GLU。從結構上看，CRM197具有完整的白喉毒素功能結構，但實驗表明，NAD結合位點的變化影響了白喉毒素的酶活性及毒性。后來研究證明52位的GLY在白喉毒素NAD結合位點起著重要作用，這就導致白喉毒素酶活性位點--同NAD：EF2ADP核糖轉移酶結合區發生改變，導致CRM197片斷A不能與EF2結合，不能對細胞起到毒性作用。

CRM197不具有酶活性以及毒性，但具有白喉毒素的免疫原性，因此CRM197也常被用作一種免疫蛋白載體交聯其它半抗原一起作為疫苗。早在1985年美國科學家就利用CRM197的免疫原性，將嗜血流感菌表面的多糖交聯到白喉類毒素及CRM197的蛋白載體上制作疫苗防治呼吸道感染，從防治效果上看，兩種交聯疫苗在效果上沒有顯著差異，但都能使小孩產生較強的免疫記憶。美國科學家針對小兒在2歲前對于肺炎球菌疫苗(球菌表面多糖，PnPs)不能產生免疫記憶，因此將球菌表面七價多糖交聯于多種蛋白載體以便在小兒2歲前能對肺炎球菌產生抗體，經過多種蛋白載體交聯后的動物及臨床效果比較，發現PnPs-CRM197能產生較好的免疫效果，而且安全無毒副作用。目前該產品也已通過美國FDA批準上市，商品名為Prevnar。意大利科學家Francesco針對流行性腦膜炎也采用了利用其病菌表面多糖交聯CRM197制作疫苗，他們從CRM197的結構上分析了交聯的可行性，其中CRM197帶有39個Lysin氨基酸殘基和16個Arg殘基，能提供較多的交聯用的游離氨基。從實驗結果來看，雖然化學交聯率較高，但都沒有達到理論交聯率。

美國專利US6,962,803描述了白喉毒素CRM107采用棒狀桿菌表達分泌到培養液中，得到的CRM107毒素收率雖然比較高，可高達培養基總蛋白的70％以上，但是由于培養基中的成分比較復雜，且鹽離子強度較高，導致后續的純化過程比較困難，工藝復雜，成本偏高，目的產物收率低等。

針對現有CRM197的不足，海南天源康澤醫藥科技有限公司對原有CRM197的基因序列進行了改進，構建了表達CRM197的重組表達質粒并轉化至大腸桿菌表達宿主中以包涵體形式表達。參見中國專利CN200610042194.7。

發明內容

對于采用大腸桿菌以包涵體形式表達重組CRM197突變體，本發明提供一種適宜于規模擴大化生產的快速、簡便、高效的CRM197突變體的純化方法，具有工藝簡單、成本低，目的產物收率高以及中間過程便于控制和易于規?；糯笊a等特點。

本發明CRM197突變體的純化方法，包括如下步驟：

(1)采用大腸桿菌以包涵體形式表達重組CRM197突變體，包涵體經過變、復性后得到含有目的蛋白組分的復性液；

(2)復性液通過超濾進行分離和濃縮，并用Tris-HCl緩沖液進行換液，將復性液濃縮5-25倍，得超濾濃縮液；

(3)上述超濾濃縮液通過陰離子交換層析進行純化層析，截留核酸和大部分雜蛋白質，得到含有目的蛋白CRM197突變體的分級組分；

(4)用平衡緩沖液對陰離子交換層析系統進行平衡，使目的蛋白吸附到陰離子層析柱上，大部分雜質穿出陰離子層析柱；

(5)用添加了NaCl的平衡緩沖溶液對上述步驟(4)處理后的陰離子交換層析柱進行洗脫，使目的蛋白穿出陰離子交換層析柱，收集洗脫蛋白液，即得目的蛋白液。

經過上述步驟的處理，得到的目標蛋白CRM197突變體的純度高，一次處理量大，且收率大大提高，為大規模生產提供了技術基礎。

上述步驟(1)中的變、復性方法可采用蛋白變、復性通用的方法。

上述步驟(2)中所述的復性液通過超濾進行分離和濃縮，可一次性進行超濾濃縮，也可先超濾去除大分子蛋白或雜質，再進行超濾濃縮。

在層析前加上超濾濃縮步驟，除去復性液中的大、小分子蛋白、多肽或其它雜質，以利于后續步驟的操作。