[發明專利]CRM197突變體的純化方法

無效

• 申請號: 200710013378.5
• 申請日: 2007-03-13
• 公開（公告）號: CN101265288A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 王克波;孫麗霞;董婷;張薛;徐同文;王晶翼
• 申請（專利權）人: 齊魯制藥有限公司
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C07K14/195;C12N1/21;C12N15/33
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司
• 代理人: 王緒銀

1.?一種CRM197突變體的純化方法，包括如下步驟：

(1)采用大腸桿菌以包涵體形式表達重組CRM197突變體，包涵體經過變、復性后得到含有目的蛋白組分的復性液；

(2)復性液通過超濾進行分離和濃縮，并用Tris-HCl緩沖液進行換液，將復性液濃縮5-25倍，得超濾濃縮液；

(3)上述超濾濃縮液通過陰離子交換層析進行純化層析，截留核酸和大部分雜蛋白質，得到含有目的蛋白CRM197突變體的分級組分；

(4)用平衡緩沖液對陰離子交換層析系統進行平衡，使目的蛋白吸附到陰離子層析柱上，大部分雜質穿出陰離子層析柱；

(5)用添加了NaCl的平衡緩沖溶液對上述步驟(4)處理后的陰離子交換層析柱進行洗脫，使目的蛋白穿出陰離子交換層析柱，收集洗脫蛋白液，即得目的蛋白液。

2.?如權利要求1所述的CRM197突變體的純化方法，其特征在于步驟(2)中所述的復性液通過超濾進行分離和濃縮，是一次性進行超濾濃縮。

3.?如權利要求1所述的CRM197突變體的純化方法，其特征在于步驟(2)中所述的復性液通過超濾進行分離和濃縮，是先超濾去除大分子蛋白或雜質，再進行超濾濃縮。

4.?如權利要求1所述的CRM197突變體的純化方法，其特征在于所述步驟(3)中所述的陰離子交換層析，所使用的陰離子交換層析柱的層析介質選自瓊脂糖凝膠類或聚苯乙烯類，配基選自季銨基或二乙基氨乙基。

5.?如權利要求1或4所述的CRM197突變體的純化方法，其特征在于所述步驟(3)中所述的陰離子交換層析，所使用的陰離子交換層析介質選自下列之一：DEAE-Sepharose?FF，Q-Sepharose?FF，SOURCE30-Q或Q-Big-Beds。

6.?如權利要求1或4所述的CRM197突變體的純化方法，其特征在于所述步驟(3)中所述的陰離子交換層析，所使用的陰離子交換層析介質DEAE-Sepharose?FF層析介質。

7.?如權利要求1所述的CRM197突變體的純化方法，其特征在于所述步驟(4)和(5)中的平衡緩沖液選用Tris-HCl緩沖液或磷酸鹽緩沖液，緩沖液的濃度為10mmol/L-1mol/L；緩沖液的pH值為6.0-11.0。

8.?如權利要求1所述的CRM197突變體的純化方法，其特征在于所述步驟(5)中所述的添加了NaCl的平衡緩沖液，其中NaCl濃度為10mmol/L-1mol/L。

9.?如權利要求1所述的CRM197突變體的純化方法，其特征在于所述步驟(5)中的洗脫方式采用非梯度洗脫或連續梯度洗脫。