[發明專利]一種枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質的分離提取方法

無效

• 申請號: 200710012540.1
• 申請日: 2007-08-22
• 公開（公告）號: CN101372502A
• 公開（公告）日: 2009-02-25
• 發明（設計）人: 李旭;張惠文;蘇振成;張成剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C07K1/16
• 分類號: C07K1/16;C12P21/00;C12R1/125
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說是一種枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質的分離提取方法。

技術背景

枯草芽孢桿菌可以產生多種抗菌物質，脂肽類抗菌物質是其中重要的一類，它們具有很強的抗菌活性，該類抗菌物質性質穩定，對高溫、酸堿、蛋白酶均具有很好的耐受性，且低毒、低殘留，在生物農藥、飼料添加劑、食品添加劑、抗真菌藥物、抗病毒藥物等方面具有潛在的應用價值，已成為當前國內外研究的一個熱點。

枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質由于結構的不同，通常被分成三個組:伊枯草菌素(iturins)、表面活性素(surfactin)和plipastatin-fengycin家族抗菌物質，iturins由7個氨基酸組成的肽鏈和1條β-氨基脂肪酸鏈構成，surfactin和plipastatin-fengycin分別由7個氨基酸和10個氨基酸組成的肽鏈及1條β-羥基脂肪酸鏈構成。

枯草芽孢桿菌及其發酵產物可作為生物農藥使用，由于其中雜質較多，限制了它的使用范圍，對其活性成分進行分離提取，可以解決雜質污染帶來的問題，使其有效成分能更好的發揮作用。目前，枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質的提取方法主要是分以下三個步驟(1)發酵液用鹽酸調至pH2.0，收集沉淀；(2)甲醇抽提；(3)反相高效液相色譜柱層析分離。現有技術取方法操作復雜、對設備要求高，可用于脂肽類抗菌物質的少量制備，不適合大規模生產。

發明內容

本發明目的在于提供一種操作簡單、快速有效、條件溫和、適合工業化生產的枯草芽孢桿菌脂肽類抗菌物質的分離提取方法。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案為:

分離提取方法:將枯草芽孢桿菌發酵液的粗提物經Sephadex?G-25柱層析，用去離子水進行洗脫，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，經Sephadex?G-25柱收集的洗脫峰再通過Sephadex?G-100柱層析，用去離子水進行洗脫，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，所得物質通過質譜檢測，即為7種脂肽類抗菌物質。

所述枯草芽孢桿菌發酵液粗提物為:將發酵的枯草芽孢桿菌液以6000-8000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液并加入發酵的枯草芽孢桿菌液2-3倍體積的丙酮，0-4℃沉淀12小時；而后再以11000-14000轉/分鐘離心10-20分鐘收集上清，所得上清液經40-60℃旋轉蒸發濃縮至原發酵液體積的5-10％，冷凍干燥后即得發酵液粗提物，待用。

所述Sephadex?G-25柱層析是將待用的枯草芽孢桿菌發酵粗提物經Sephadex?G-25層析柱層析，用去離子水進行洗脫，流速為0.15-0.2mL/min，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，所得洗脫峰冷凍干燥，待用。

所述SephadexG-100柱層析是將經Sephadex?G-25層析柱層析收集的物質，再經Sephadex?G-100層析柱純化，用去離子水進行洗脫，流速為0.15-0.2mL/min，收集具有抗啤酒酵母活性的洗脫峰，所得洗脫峰冷凍干燥，待用。

本發明所具有的優點:

本發明提供的方法可快速有效分離提取枯草芽孢桿菌發酵液中脂肽類抗菌物質，其制備工藝簡單快速，操作條件溫和，對試劑、儀器設備要求低，更適合于工業化生產。分離提取后通過MALDI-TOF質譜及氨基酸組成分析確定出分離的7種脂肽類抗菌物質的分子構成，其7種脂肽類抗菌物質為C₁₆itruin?A(M+H)、C₁₆itruin?A(M+Na)、C₁₆itruin?A(M+K)、C₁₇itruinA(M+H)、C₁₇itruin?A(M+Na)、C₁₇itruin?A(M+K)和C₁₅surfactin?C(M+K)。

并且分離的7種脂肽類抗菌物質具有廣譜的抗真菌活性，可用于番茄早疫病、芹菜菌核病、萵筍菌核病、黃瓜枯萎病、蘋果輪紋病等植物真菌病害的防治；同時，該7種脂肽類抗菌物質也可做為飼料添加劑用于防治黃曲霉等真菌引起的霉變，另外它們在抗真菌、抗病毒、抗腫瘤方面也具有潛在的應用價值。

附圖說明

圖1為本發明分離出7種脂肽類抗菌物質的MALDI-TOF質譜圖。

具體實施方式

枯草芽孢桿菌發酵液的粗提物的制備: