[發(fā)明專利]一種早期診斷類風濕關節(jié)炎的免疫球蛋白G糖基化檢測試劑及制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710011899.7
• 申請日: 2007-06-26
• 公開（公告）號: CN101074951A
• 公開（公告）日: 2007-11-21
• 發(fā)明（設計）人: 燕秋;富力;朱正美;張文利;馬悅;王曉琦
• 申請（專利權）人: 大連醫(yī)科大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/543
• 代理公司: 大連萬友專利事務所
• 代理人: 王發(fā)

技術領域?本發(fā)明涉及一種診斷類風濕關節(jié)炎的檢測試劑及制備方法。

背景技術?類風濕關節(jié)炎(rheumatoid?arthritis，RA)是以關節(jié)進展性破壞為主，并累及其他多種臟器的常見病。其發(fā)病率可高達5％。RA的病情特點為反復發(fā)作，呈進展性加重，如從關節(jié)晨僵、紅腫到關節(jié)破壞，及使病人喪失活動能力等。類風濕關節(jié)炎被稱為“不死的癌癥”，它給病人帶來了極大的身心痛苦和經濟負擔。類風濕關節(jié)炎如能在早期予以正確診斷并合理治療，病情將可得到緩解或趨于穩(wěn)定。目前類風濕關節(jié)炎現(xiàn)常用的診斷方法有實驗室檢測和X-光片方法等。其中實驗室檢測方法主要包括IgG、類風濕因子(RF)、血沉、C-反應蛋白測定等。但是這些方法各有不足之處：IgG測定是病人血中總IgG水平的測定，不同人IgG水平變化范圍較大，且免疫功能低下的病人并不伴有IgG升高；血沉和C-反應蛋白是反映病情活動期的一個指標，在多種疾病可有不同程度的升高，如結核、血液病和炎癥等；類風濕因子出現(xiàn)較晚，并且儀有30-40％的病人為陽性，并同時受總IgG水平的影響；X-光片診斷是依據(jù)骨關節(jié)密度等診斷類風濕關節(jié)炎的指標，當類風濕關節(jié)炎病人出現(xiàn)骨改變時有意義，它也是一個較晚期出現(xiàn)的指標。

發(fā)明內容?本發(fā)明的目的在于提供一種特異靈敏且指標與發(fā)病機制直接相關的一種早期診斷類風濕關節(jié)炎的免疫球蛋白G糖基化檢測試劑及制備方法。本發(fā)明主要是利用糖與凝集素及抗原與抗體的特異結合，偶聯(lián)IgG分子中的糖鏈和蛋白鏈進行測定，即通過含有N-連接糖鏈的IgG分子糖基化水平的凝集素-親和免疫測定診斷類風濕關節(jié)炎的一種試劑及制備方法。

本發(fā)明的技術方案概括如下：

利用凝集素-親和免疫方法主要為：選擇特異結合IgG半乳糖糖鏈末端的凝集素或去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖鏈的凝集素包被酶標板，BSA封閉、加入待測樣品、加入標記IgG抗體、顯色和分析、酶標儀檢測等。通過對病人體液(血清或關節(jié)滑液等)含半乳糖末端糖鏈的IgG糖基化降低的測定，或去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖鏈的IgG糖基化增加的測定，診斷類風濕關節(jié)炎；雙重測定IgG糖基化的變化，即平行測定含半乳糖末端糖鏈的IgG糖基化的降低，和去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖鏈的IgG糖基化的增加，根據(jù)兩測定比值來判斷IgG的糖基化異常。

本發(fā)明的具體方案如下：

一、檢測含半乳糖末端糖鏈的IgG糖基化變化(降低)的試劑及制備方法

(一)試劑：主要包括有花生凝集素(PNA)包被酶標板(條)、洗滌液吐溫(Tween)20-PBS(TPBS)、牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封閉液、辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgG抗體、顯色底物(四甲基聯(lián)苯胺，TMB)、反應終止液H₂SO₄。

(二)制備方法

1.用特異結合IgG半乳糖糖鏈末端的凝集素，花生凝集素(PNA)包被酶標板(條)，濃度為0.05-20μg/ml(溶于碳酸鹽緩沖液中，pH9.6)，體積為150-400μl，4℃過夜。

2.用洗滌液0.01-0.1％吐溫(Tween)20-PBS(TPBS)洗酶標板(條)2-5次，每次5-30分鐘。洗滌過程中同時振搖(以下洗滌同)。

3.加200-500μl?1-3％牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封閉液，4℃過夜。

4.用TPBS洗酶標板(條)2-4次，每次3-10分鐘。

5.每孔加待測體液(或對照)樣品50-300μl，37℃溫育1小時。

6.用TPBS洗滌2-5次，每次5-20分鐘。

7.加100-300μl辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗人IgG抗體(1∶400-3000稀釋)，溫育10-30分鐘。

8.用TPBS洗滌2-5次，每次5-20分鐘。

9.加100-300μl?HRP的顯色底物(四甲基聯(lián)苯胺，TMB)，避光顯色5-15分鐘。用TPBS洗滌2-5次，每次2-5分鐘。

10.加反應終止液40-300μl?2N?H₂SO₄終止反應。

11.在酶標儀A450nm波長處檢測反應孔的吸光值，正常值范圍：0.60-0.80。

二、檢測去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖鏈的IgG糖基化變化(增加)的試劑及方法