[發明專利]一種早期診斷類風濕關節炎的免疫球蛋白G糖基化檢測試劑及制備方法

無效

• 申請號: 200710011899.7
• 申請日: 2007-06-26
• 公開（公告）號: CN101074951A
• 公開（公告）日: 2007-11-21
• 發明（設計）人: 燕秋;富力;朱正美;張文利;馬悅;王曉琦
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/543
• 代理公司: 大連萬友專利事務所
• 代理人: 王發

1.一種早期診斷類風濕關節炎的免疫球蛋白G糖基化檢測試劑及檢測方法，其特征在于：用與糖鏈特異結合的凝集素及標記的IgG抗體，對IgG的糖基化進行凝集素—親和免疫檢測，其包括(1)測定含半乳糖末端糖鏈的IgG糖基化的降低，(2)測定去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖鏈的IgG增加，(3)雙重測定IgG糖基化的變化即同時測定含半乳糖末端糖鏈的IgG糖基化的降低，和N-乙酰葡萄糖胺次末端糖鏈的IgG糖基化的增加，并計算兩者測定的比值。

2.根據權利要求1所述的早期診斷類風濕關節炎的免疫球蛋白G糖基化檢測試劑及檢測方法，其特征在于：(1)所述酶標板(條)的每孔用溶于碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中的一種特異結合半乳糖末端糖鏈的花生凝集素包被，濃度為0.05-20μg/ml，體積為150-400μl，4℃過夜，(2)用0.01-0.1％吐溫(Tween)20-PBS(TPBS)洗滌酶標板2-5次，每次5-30分鐘，(3)加入200-500μl?1-3％牛血清白蛋白(BSA)-TPBS封閉液，4℃過夜，(4)用TPBS洗酶標板(條)2-4次，每次3-10分鐘，(5)加入待測體液50-300μl，37℃溫育10分鐘-1小時，(6)TPBS洗滌2-5次，每次5-20分鐘，(7)加100-300μl辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG抗體(1∶400-3000)，溫育10-30分鐘，(8)TPBS洗滌2-5次，每次5-20分鐘，(9)加100-300μlHRP的顯色底物(四甲基聯苯胺，TMB)，避光顯色5-15分鐘，TPBS洗滌2-5次，每次2-5分鐘，(10)加40-300μl?2N?H2SO4終止反應，(11)在酶標儀A450nm波長處測定吸光值。

3.根據權利要求1所述的早期診斷類風濕關節炎的免疫球蛋白G糖基化檢測試劑及檢測方法，其特征在于：(1)所述酶標板(條)的每孔用溶于碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中的一種特異結合N-乙酰葡萄糖胺次末端糖鏈的蘑菇凝集素包被，濃度為0.05-20μg/ml，體積為150-400μl，4℃過夜，(2)用0.01-0.1％?TPBS洗滌2-5次，每次5-30分鐘，(3)加入200-500μl?1-3％牛血清白蛋白BSA-TPBS封閉液，4℃過夜，(4)用TPBS洗酶標板(條)2-4次，每次3-10分鐘，(5)加入待測體液50-300μl，37℃溫育10分鐘-1小時，(6)TPBS洗滌2-5次，每次5-20分鐘，(7)加100-300μl堿性磷酸酶標記的IgG抗體(1∶500-2000)，溫育10-30分鐘，(8)TPBS洗滌2-5次，每次5-20分鐘，(9)加100-300μl堿性磷酸酶標記的顯色底物(對-硝基苯磷酸酯，p-NPP)，避光顯色5-15分鐘，TPBS洗滌2-5次，每次2-5分鐘，(10)加40-300μl?1N?NaOH溶液終止反應，(11)在酶標儀A405nm波長處測定吸光值。

4.根據權利要求2和3所述的早期診斷類風濕關節炎的免疫球蛋白G糖基化檢測試劑及檢測方法，其特征在于：(1)采用權利要求2的方法測定含半乳糖末端糖鏈的IgG糖基化的吸光值，(2)采用權利要求3的方法測定去半乳糖后所暴露的N-乙酰葡萄糖胺次末端糖鏈的吸光值，(3)計算步驟(2)獲得的檢測值/步驟(1)獲得的檢測值的比值。