[發(fā)明專利]一種芐嘧磺隆高效降解菌株的篩選及降解活性的鑒定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200710011800.3
• 申請日: 2007-06-20
• 公開（公告）號: CN101328467A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發(fā)明（設計）人: 張曉黎;張惠文;蘇振成;李旭;張成剛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 許宗富;周秀梅

技術領域

本發(fā)明涉及生物降解農(nóng)藥殘留技術領域，具體地說是一種芐嘧磺隆高效降解菌株的篩選及降解活性的鑒定方法。

背景技術

芐嘧磺隆，又稱芐磺隆、亞磺隆，商品名為農(nóng)得時(Londax)，化學名稱：2-{[(4，6-二甲氧基嘧啶-2-基)氨基羰基氨基]磺酰基甲基]}苯甲酸甲酯(Methyl-2-{[(4，6-dimethoxy-pyrimidin-2-yl)aminocarbonylamino]sulfonylmethyl}benzoate)。分子式為C₁₆H₁₈N₄O₇，分子量為410.40，化學結(jié)構(gòu)式為：

芐嘧磺隆是20世紀80年代中期美國杜邦公司開發(fā)的一種新型磺酰脲類除草劑，具有高效、低毒、廣譜、用量少、價格低廉等優(yōu)點，是目前廣泛用于稻田、麥田雜草防治的主要除草劑之一。但是它在土壤中的殘留周期較長(在黏土中半衰期4～20周)，難揮發(fā)，不易降解，易對后茬敏感作物造成危害。因此，解決芐嘧磺隆殘留的降解問題已成為當前農(nóng)殘降解領域研究的熱點。

目前，國內(nèi)外很多專家采取了一系列措施來減少芐嘧磺隆殘留所造成的危害，主要有添加復配劑降低芐嘧磺隆的用量，開發(fā)抗藥性轉(zhuǎn)基因作物等，但這些措施并不能從根本上解決農(nóng)藥殘留問題。因此，研制芐嘧磺隆生物降解菌劑具有十分重要的意義，但由于很難篩選出芐嘧磺隆的高效降解菌株，目前仍未見芐嘧磺隆降解菌劑的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高效、廉價的芐嘧磺隆高效降解菌株的篩選及其降解活性的鑒定方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

高效降解菌株的篩選方法包括以下步驟：

1)降解菌的富集馴化：取8～10g接種源置入三角瓶中，加入80～100m?l芐嘧磺隆濃度為50～100mg/L的富集培養(yǎng)基和5～10g玻璃珠(將接種源充分打勻)，于28～30℃，150～180r/min搖床培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)5～7天，備用；將培養(yǎng)液按體積百分比5～10％的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為100～150mg/L的新的富集培養(yǎng)基中，于28～30℃，150～180r/min條件下振蕩培養(yǎng)5～7天，而后將富集培養(yǎng)中的芐嘧磺隆以50mg/L的濃度梯度遞增，按上述接種量和培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3～4次，得到富集菌液，待用；

2)分離篩選：在80～100ml芐嘧磺隆濃度為100～150mg/L的選擇性無機鹽培養(yǎng)基中，按體積百分比5～10％的接種量接種步驟1)中的富集菌液，于28～30℃，180～200r/min條件下振蕩培養(yǎng)5～7天；而后將培養(yǎng)液按體積百分比5～10％的接種量接種于芐嘧磺隆濃度為100～150mg/L的新的選擇性無機鹽培養(yǎng)基中，按上述培養(yǎng)過程再轉(zhuǎn)接3～4次，得到以芐嘧磺隆為唯一碳源的混合菌液，待用；

3)復壯、純化：將分離篩選所得的混合菌液，稀釋10⁶～10⁸倍，涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板上，28～30℃培養(yǎng)2～3天，挑選不同性狀的單菌落在牛肉膏蛋白胨平板上劃線純化；

4)驗證降解菌：將步驟3)中純化好的菌株在選擇性無機鹽培養(yǎng)基固體平板上劃線，其中選擇性培養(yǎng)基內(nèi)添加芐嘧磺隆至終濃度為100～150mg/L，28～30℃培養(yǎng)3～4天，能夠生長的菌株即為能夠以芐嘧磺隆為唯一碳源的降解菌株。

5)鑒定降解菌株的降解活性：利用玉米生測法初篩出高活性的降解菌株，再利用高效液相色譜法確定高效菌株的降解率。